Hybridizace nukleových kyselin
Tvorba dvouřetězcových hybridů ze dvou
jednořetězcových a alespoň částečně
komplementárních molekul nukleových kyselin
Založena na schopnosti denaturace a renaturace
DNA.
Denaturace a renaturace DNA
 Espero Publishing, s.r.o.
Denaturace DNA
ˇ oddělení komplementárních vláken DNA
působením vysoké teploty (90-100oC),
extrémních hodnot pH nebo denaturačních
činidel (formamid, močovina)
ˇ změna v uspořádání bazí při denaturaci
zvyšuje absorbci světla při vlnové délce
260 nm (hyperchromní efekt)
PouPoužžititíí spektroskopie pro analýzuspektroskopie pro analýzu DNADNA
DNA absorbuje UV světlo při vlnové délce 260 nm
OpticalDensity
Wave Length
260
Měření absorbce lze
využít, protože se mění v
závislosti na struktuře
DNA (&RNA):
dsDNA
Nízký
extinkční
koeficient
ssDNA
Vyšší extinkční
koeficient
PrPrůůbběěh denaturace ih denaturace i renaturacerenaturace DNADNA
lze sledovatlze sledovat spektrofotometrickyspektrofotometricky
Teplota tání DNA Tm
- odpovídá teplotě, kdy je molekula DNA denaturována z
jedné poloviny
Monitorování teploty tání dsDNA
Teplota tání (denaturace) závisí na
čtyřech hlavních faktorech:
- obsahu GC (a AT)
- koncentraci solí
- délce sekvence
- přítomnosti nespárovaných úseků
GC rich
GC rich
AT rich
Temp Temp
Teplota tání DNA Tm se lineárně zvyšuje s obsahem G+C
ˇ Obsah G+C v DNA se u různých
organismů pohybuje od 22% - 73%
ˇ Vliv obsahu G+C na Tm vyplývá z
faktu, že páry G-C jsou spojeny
třemi vodíkovými vazbami a páry
A-T dvěma
Vliv dalších faktorů na denaturaci DNA
ˇ organická rozpouštědla jako DMSO (dimethyl
sulfoxide) a formamid přerušují vodíkové můstky
mezi řetězci DNA
ˇ změny pH rovněž porušují vodíkové můstky
ˇ snížení obsahu solí odstraňuje ionty, které
poskytují ,,ochranu" negativním nábojům v molekule
DNA (eliminace vzájemného ovlivňování nabitých
skupin): DNA lze denaturovat při nižší teplotě
ˇ Spojené řetězce snižují
absorbanci
ˇ Při denaturaci absorbance
stoupá o 30-40%
ˇ Z toho vyplývá, že řetězce
drží pevně pohromadě
dokud se nedosáhne Tm,
pak se duplex rychle
rozpadá
OpticalDensity(@260nm)
Temperature (C)Tm
HYPERCHROMIC SHIFT
Hyperchromní efekt
Renaturace
ˇ opětná tvorba dvouřetězcových struktur z
jednořetězcových polynukleotidů za vhodných
připojovacích (,,annealing") podmínek
ˇ nastává při pomalém ochlazování (65oC) roztoku
teplem denaturované DNA
ˇ nenastává při prudkém ochlazení roztoku
denaturované DNA
ˇ při renaturaci se mohou tvořit hybridní molekuly
DNA/DNA, RNA/RNA i DNA/RNA
ˇ rozsah renaturace odpovídá rozsahu
komplementarity sekvencí
Faktory ovlivňující tvorbu hybridů
ˇ teplota
ˇ koncentrace solí
ˇ stupeň
komplementarity
ˇ délka fragmentů
Využití hybridizace nukleových kyselin
ˇ test komplementarity sekvencí (ve směsi mnoha
molekul DNA budou hybridizovat jen ty, které jsou
dostatečně komplementární)
ˇ detekce molekul DNA a RNA, které jsou
komplementární k jakékoliv izolované nukleové
kyselině
ˇ základem hybridizace je obvykle značená sonda o
známé nukleotidové sekvenci
Faktory ovlivňující rychlost
hybridizace
ˇ velikost sondy
ˇ teplota
ˇ iontová síla roztoku
ˇ stupeň komplementarity DNA a sondy
ˇ koncentrace sondy
ˇ komplexita sondy (přítomnost
autokomplementárních sekvencí)
ˇ nukleotidové složení sondy
ˇ přítomnost denaturačních činidel (formamid)
ˇ viskozita
ˇ pH
Uspořádání hybridizačního experimentu je
rozmanité podle povahy prostředí, ve kterém
probíhá
Typický hybridizační experiment ­
Southernův přenos
ˇ technika vyvinuta E.M. Southernem
Běžné použití:
ˇ detekce přítomnosti určitých genů v
buněčné DNA
ˇ sledování evoluční příbuznosti vzorků
DNA z různých organismů
Southernův přenos - postup
ˇ příprava a značení sondy
ˇ rozdělení restrikčních fragmentů DNA daného
vzorku gelovou elektroforézou
ˇ denaturace DNA a přenos jednořetězcových
fragmentů DNA na nylonový filtr (,,blotting" -
přesávka)
ˇ inkubace filtru se značenou jednořetězcovou
sondou: hybridizace sondy s komplementární
sekvencí imobilizovanou na filtru
ˇ odmytí nenavázané sondy
ˇ detekce navázané sondy - vizualizace hybridů
(autoradiografie)
Detekce specifického fragmenu kapilárním
přenosem a hybridizací (Southern blotting)
 Espero Publishing, s.r.o.
Southernův přenos - část I: gelová
elektroforéza a přenos na membránu
DNA Cleaved with a
restriction enzyme
Smear of restriction fragments
Southernův přebos - část II:
Hybridizace DNA vázané na
membráně se sondou
DNA obarvená
etidium bromidem
autoradiogram
Southernův přenos
Typy sond
ˇ restrikční fragmenty dvouřetězcové DNA
ˇ mRNA izolovaná z buněk nebo tkání
ˇ RNA transkripty in vitro
ˇ syntetické oligonukleotidy (připravené
podle sekvence aminokyselin)
Způsoby značení sond
ˇ prostřednictvím náhodných hexanukleotidů
(,,random primer DNA labeling")
ˇ posunem jednořetězcového zlomu
(,,nick translation")
ˇ koncové značení
ˇ značení vektoru s naklonovanou sondou
ˇ značení transkriptů in vitro
Značení DNA pomocí
náhodných
oligonukleotidů
,,Random primer DNA
labeling"
ˇ k ssDNA se přidá směs
hexanukleotidů o různé
sekvenci
ˇk těmto primerům připojuje
DNA polymeráza značené
nukleotidy
Značení DNA posunem
jednořetězcového zlomu
,,Nick translation"
Vytvoření náhodných jednořetězcových
zlomů DNázou I
DNA polymeráza I odstraňuje
nukleotidy od místa zlomu
(exonukleázová aktivita 5´- 3´)
Současně ve stejném směru připojuje
značené nukleotidy k 3´konci zlomu
Značení konců fragmentů DNA
a) značení 5´konců
Značení konců DNA fragmentů
b) značení 3´ konců
Značení 3´konců DNA T4-DNA-polymerázou
Příprava sondy
značením vektoru
Příprava značených
transkriptů
Značení syntetických oligonukleotidů
ˇ na 5´konci T4-polynukleotid
kinázou
ˇ Klenowovou polymerázou
Vlastnosti radioizotopů používaných v biologickém
výzkumu
Izotop síry lze využít při značení nukleových
kyselin
Radioaktivita
ˇ vyplývá z nestabilní kombinace
protonů a neutronů v izotopech
ˇ atom má tendenci se rozpadnout a
dostat se do stabilnější konfigurace
ˇ rozpad radioaktivních izotopů vede k
uvolnění energie ve formě záření,
které lze monitorovat
Detekce radioizotopů
ˇ kvalitativní: autoradiografie
ˇ kvantitativní: - počítače Geiger
- tekutá scintilační spektrometrie
Neradioaktivní značení sond DNA
ˇ digoxineninem
ˇ biotinem
ˇ fluorescenčními značkami
Neradioaktivní značení nukleových kyselin digoxigeninem
Detekce digoxigeninu
- protilátkou s navázanou alkalickou fosfatázou (AP)
Substrát pro AP: A) X-fosfát + NBT
B) chemoluminiscenční látka
Detekce: A) barevná reakce
B) zachycení uvolněného světla na filmu
Neradioaktivní značení nukleových kyselin biotinem
K značení NK se používá např. biotin-16-dUTP
(analog TTP)
Detekce DNA značené bio-dUTP:
1. avidin (streptavidin) - AP konjugát
ˇ chromogenní substrát (X-fosfát + NBT)
ˇ barevná reakce
2. avidin (streptavidin) - luciferáza
ˇ substrát (luciferin)
ˇ emise světla
3. avidin (streptavidin) - peroxidáza
ˇ substrát (luminol)
ˇ emise světla
Typy filtrů pro přenos nukleových kyselin
ˇ nitrocelulózové filtry (0,1-0,45 m)
ˇ nylonové membrány (0,1-0,45 m)
ˇ chemicky modifikovaný papír nebo celulóza
(DBM - diazobenzyloxymetyl,
APT-aminofenyltioester)
Způsoby přenosu (,,blotingu")
ˇ kapilární přenos
ˇ elektroforetický přenos
ˇ vakuový přenos
Kapilární přenos
Vakuový přenos
Imobilizace nukleových kyselin na filtrech
ˇ zapékání
ˇ ,,UV-crosslinking"
Hybridizační postup
1. Prehybridizace - zabránění
nespecifické vazbě sondy na membránu
(Denhardtův roztok, BLOTTO, heparin,
heterologní DNA)
2. Hybridizace - navázání sondy na
komplementární sekvence (68oC, 42oC s
formamidem)
- lze volit různé podmínky (,,stringence")
Hybridizační postup
3. Promývání - odstranění nenavázané sondy
(účinnost je ovlivněna teplotou, koncentrací
solí)
4. Detekce navázané sondy
- autoradiografie
- imunologická reakce - barvení
- luminiscence
- fluoroscence
Hybridizační postup
5. Rehybridizace
- odmytí navázané sondy
- aplikace další sondy
Stupeň stringence
Blot je hybridizován při podmínkách vysoké
stringence pro detekci nukleových kyselin,
které jsou vysoce homologní nebo identické
se sondou.
Různé hybridizační podmínky umožňují vytvoření
dvojšroubovice s některými nespárovanými nukleotidy
Typy přenosu (,,blotingu") podle
typu analyzovaných molekul
ˇ Southernův přenos - DNA (Dr. Edwin
Southern)
ˇ northernový přenos - RNA
ˇ westernový přenos - proteiny
ˇ southwesternový přenos - proteiny
vážoucí DNA (sondou je DNA)
ˇ northwesternový přenos - proteiny
vážoucí RNA(sondou je RNA)
Tečková hybridizace (,,dot blot")
Postup:
ˇ sonikace nebo restrikce genomové DNA;
linearizace plazmidové DNA
ˇ denaturace
ˇ vzorky DNA naneseny na podložku v podobě
teček
ˇ hybridizace se sondou
ˇ hodnocení hybridizace (vizuálně,
denzitometrem, -spektrometrem)
Hybridizace in situ
Detekce DNA nebo RNA v intaktních buňkách
radioaktivními nebo fluorescenčními sondami.
Využití:
ˇ prostorová lokalizace nukleových kyselin v
buňkách a tkáních (hybridizace buněčné RNA)
ˇ lokalizace genů (sekvencí) na chromozómech
(hybridizace jaderné DNA)
Buňky produkující určitou mRNA mohou být
vizualizovány hybridizací in situ.
Snímek ukazuje buňky vrcholové části hledíku.
Sonda specifická pro mRNA cyklinu barví buňky tmavě
modře, ostatní buňky jsou barveny DAPI (světlá modř)
Použití hybridizace in situ pro detekci genů
na chromosomech (FISH)
Použito 6 různých sond pro
analýzu sekvencí v lidském
metafázním chromozomu 5.
Každá sonda vytváří 2 tečky na
každém chromozomu (mitózou je
DNA zreplikována).
Postup hybridizace in situ
ˇ příprava cytologického preparátu
ˇ fixace objektu
ˇ hybridizace se značenou sondou
ˇ autoradiografie nebo stanovení
fluorescence
ˇ barvení preparátu
ˇ světelná nebo fluorescenční
mikroskopie
Obvyklá fluorescenční barviva
ˇ fluorescein (zelená fluorescence)
ˇ rhodamin (červená fluorescence)
ˇ kumarin (modrá fluorescence)
Využití hybridizačních
technik v praxi
Detekce rekombinantních klonů
- v bakteriích
- ve fágách
Postup:
ˇ výsev na plotnu (100-1000 CFU/PFU)
ˇ růst do velikosti 0,1-0,2 mm
ˇ přenos na 1 - 2 filtry
ˇ růst na filtru
ˇ denaturace DNA
ˇ neutralizace
ˇ hybridizace
ˇ autoradiografie
ˇ vyhledání odpovídajících kolonií (plak)
obsahujících hledanou sekvenci DNA
Detekce bakteriálního klonu nesoucího
určitý fragment DNA
Vyhledání klonu
nesoucího specifický gen
Izolace klonu produkujícího specifický
protein
Používání oligonukleotidových sond
odvozených ze struktury proteinů
Lokalizace specifických sekvencí v
genomové DNA
Southernova analýza potomků
heterozygotních rodičů (RFLP)
Pokud je výskyt většího fragmentu spojen s nemocí je
třeba sledovat dceru #1, sourozenci #2 a 3 jsou přenašeči
Detekce mutace způsobující srpkovitou anémii
Na základě znalostí molekulární biologie můžeme
dojít od proteinové sekvence ke genu a naopak