Klonování
Klonování: proces tvorby klonů
Klon: soubor geneticky identických buněk (resp.
organismů), odvozených ze společného předka
Klonování DNA: tvorba klonů DNA
Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo
úseků DNA, připravených např. množením
rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in
vivo) nebo PCR (in vitro)
Rekombinantní molekula DNA: molekula DNA vytvořená
spojením cizorodé (klonované) DNA s klonovacím
vektorem
Klonování DNA
Stěžejní metoda molekulární biologie:
umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např.
geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně
zmnožit a zpřístupnit je tak dalšímu studiu
Využití klonování DNA:
ˇ izolace genů
ˇ studium regulačních oblastí, které řídí genovou expresi
ˇ fyzikální a genetická analýza genomů
ˇ exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní
exprese) za účelem přípravy žádaných produktů
ˇ základ genového inženýrství (příprava transgenních organismů)
Klonování zahrnuje 3 kroky
1. příprava rekombinantní molekuly DNA
2. přenos rekombinantní molekuly do hostitelské
buňky
3. Selekce klonů obsahujících rekombinantní DNA
Pro zajištění bodu 2 jsou zapotřebí klonovací
vektory
Klonovací vektory
ˇ nejčastěji kružnicové molekuly DNA schopné
autonomní replikace
ˇ obvykle odvozené z plazmidů nebo virů
ˇ navíc obsahují pomocné sekvence různého
původu usnadňující vložení cizorodé DNA, její
expresi, selekci transformantů, apod.)
Typy vektorů
Plazmidové: pBR322, pUC18, BACs
Fágové: - odvozené od bakteriofága Lambda
- odvozené od fága M13
Kosmidy: hybridy mezi plazmidy a fágy
Vektory pro eukaryontní buňky:
- kvasinkové
- rostlinné
- živočišné
Plazmidové vektory
Vlastnosti:
ˇ jednoduchá manipulace
ˇ přirozený výskyt v mnoha druzích bakterií
ˇ variabilita ve velikosti: jednotky kb ­ stovky
kb (pro klonování obvykle 2-15 kb)
ˇ většina odvozena od plazmidu ColE1 bakterie
E. coli
Přirozené plazmidy
ˇ extrachromozomální molekuly DNA, obvykle kruhové,
dvouřetězcové, tvořící nadšroubovici
ˇ typ bakteriálního parazita ve formě DNA: schopnost
replikace uvnitř bakterie, občasný přechod do jiné
buňky
ˇ výhoda poskytovaná plazmidem hostitelské buňce je
zároveň výhodou pro plazmid
ˇ zodpovídají za šíření genů pro rezistenci k antibiotikům
ˇ je zakázáno provádět takové experimenty, které by
mohly způsobit rozšíření nových genů pro rezistenci k
antibiotikům v patogenních bakteriích
Výhodné vlastnosti plazmidových vektorů
ˇ autonomní replikace v bakteriální buňce
ˇ tvorba více kopií v buňce
ˇ schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při
replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací
(bezpečnost práce s novými konstrukty)
ˇ přítomnost restrikčních (klonovacích) míst,
využitelných pro klonování
ˇ snadný a účinný přenos do hostitelských buněk
ˇ přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci
hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum)
ˇ malá velikost (zvýšení účinnosti transformace,
jednoduchá izolace)
Replikace plazmidů
ˇ základní předpoklad pro využití plazmidů jako
klonovacích systémů (namnožení fragmentu DNA)
ˇ hostitelské buňka je vybavena veškerým aparátem pro
replikaci DNA
Počátek replikace (ori)
- genetická informace, kterou musí plazmid disponovat,
aby mohl být v bakteriální buňce replikován
- je tvořen jen několika stovkami párů bazí
Výhodné vlastnosti plazmidových vektorů
ˇ autonomní replikace v bakteriální buňce
ˇ tvorba více kopií v buňce
ˇ schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při
replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací
(bezpečnost práce s novými konstrukty)
ˇ přítomnost restrikčních míst, využitelných pro
klonování
ˇ snadný a účinný přenos do hostitelských buněk
ˇ přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci
hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum)
ˇ malá velikost (zvýšení účinnosti transformace)
Tvorba více kopií plazmidu v buňce
ˇ Deriváty ColE1 jsou ,,multi-copy" plazmidy
ˇ ColE1 divokého typu ­ cca 15 kopií v 1 buňce
ˇ Uměle vylepšené deriváty ­ několik set kopií
Výhody
- snadná purifikace s vysokými výtěžky
- vysoká exprese klonovaného genu
Nevýhody:
- pomalejší růst hostitelské buňky
- nadměrná exprese klonovaného genu může být pro
buňku zátěž
Výhodné vlastnosti plazmidových vektorů
ˇ autonomní replikace v bakteriální buňce
ˇ tvorba více kopií v buňce
ˇ schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při
replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací
(bezpečnost práce s novými konstrukty)
ˇ přítomnost restrikčních míst, využitelných pro
klonování
ˇ snadný a účinný přenos do hostitelských buněk
ˇ přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci
hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum)
ˇ malá velikost (zvýšení účinnosti transformace)
Plazmidy a rozmezí hostitelů
ˇ některé plazmidy se replikují v rozmanitých
bakteriálních druzích (široké rozmezí hostitelů): RP4,
RSF1010, pC194
ˇ většina vektorů užívaných pro klonování se replikuje jen
v úzkém rozmezí hostitelů
Výhoda:
- snížení rizika rozšíření pozměněné genetické informace
Nevýhoda:
- pokud potřebujeme experimentovat s jinými bakteriemi
než E. coli musíme si připravit ,,vlastní vektor" se
specifickým ori
Pendlující (bifunkční, ,,shuttle") vektory
pJK3-1, pKT240, PGC3311
ˇ Možný přenos mezi dvěma bakteriálními druhy
ˇ 2 místa ori v jednom plazmidu
Výhodné vlastnosti plazmidových vektorů
ˇ autonomní replikace v bakteriální buňce
ˇ tvorba více kopií v buňce
ˇ schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při
replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací
(bezpečnost práce s novými konstrukty)
ˇ přítomnost restrikčních míst, využitelných pro
klonování
ˇ snadný a účinný přenos do hostitelských buněk
ˇ přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci
hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum)
ˇ malá velikost (zvýšení účinnosti transformace)
Klonovací místo
ˇ unikátní restrikční místo (zastoupené
pouze jednou v molekule plazmidu), do
kterého se začleňuje cizorodá DNA
ˇ větší počet různých restrikčních míst
se obvykle seskupuje do krátkého
úseku DNA (mnohočetné klonovací
místo, polylinker)
ˇ poloha klonovacího místa nesmí narušit
funkci oblasti ori nebo jiné důležité
funkce plazmidu
ˇ začlenění fragmentu DNA do určitého
klonovacího místa vede k vzniku
rekombinantního plazmidu se dvěma
cílovými místy téhož restrikčního
enzymu - možno využít pro identifikaci
rekombinantního plazmidu
Výhodné vlastnosti plazmidových vektorů
ˇ autonomní replikace v bakteriální buňce
ˇ tvorba více kopií v buňce
ˇ schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při
replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací
(bezpečnost práce s novými konstrukty)
ˇ přítomnost restrikčních míst, využitelných pro
klonování
ˇ snadný a účinný přenos do hostitelských buněk
ˇ přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci
hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum)
ˇ malá velikost (zvýšení účinnosti transformace)
Přenos plazmidových vektorů do
hostitelských buněk
Transformace:
ˇ bakterie uvedeny do stavu kompetence (u E.coli
působeních chloridu vápenatého za nízké teploty)
ˇ po přidání DNA a krátkém zahřátí na 42 oC) přechází
transformující DNA do buněk
Elektroporace:
ˇ buňky jsou vystaveny krátkému elektrickému impulsu o
vysokém napětí ­ v buněčné stěně vznikají póry,
kterýmiexogenní DNA vstupuje do buněk
Transformace bakteriálních buněk
ˇ závislá na stavu kompetence buněk
ˇ u některých bakterií se stav kompetence
objevuje přirozeně (S. pneumoniae)
ˇ u E.coli se připravuje uměle - promytím buněk
ledovým CaCl2
- přidání DNA
- mírný teplotní ,,šok" (2 min, 42oC)
- krátká inkubace v růstovém médiu (zotavení
bakterií, exprese selekčního markeru)
Výtěžek při transformaci E.coli
teplotním šokem
ˇ klasický postup: 104 transformantů /g DNA
ˇ postupné vylepšování metody (odlišné soli při
přípravě kompetentních buněk, speciální
varianty E.coli): max. 109/ g DNA
Transformace bakterií
elektroporací
ˇ promytí buněk vodou (odmytí elektrolytů z
růstového média)
ˇ krátký elektrický puls o vysokém napětí
ˇ dočasné otvory v buněčném obalu
ˇ vstup DNA do buňky
Výhody elektroporace
ˇ vyšší účinnost přenosu
ˇ funguje u různých bakterií
Nevýhody elektroporace
ˇ nutno optimalizovat řadu parametrů (růstové
podmínky, teplota, délka pulzu, napětí)
ˇ otvory mohou pronikat do buněk i jiné molekuly
(RNA, proteiny)
ˇ není zajištěn směr přenosu
Selekční markery
ˇ nezbytné pro funkci vektoru
ˇ procesy ligace i transformace jsou málo účinné: max.
1% bakteriálních buněk (E. coli) DNA přijme, v praxi
obvykle méně
ˇ nutnost zabránit v růstu netransformovaným buňkám
ˇ obvykle zajištěno genem, který hostitelským buňkám
poskytne rezistenci na antibiotikum
Gen bla
ˇ kóduje enzym -laktamázu
ˇ -laktamáza hydrolyzuje -laktamová
antibiotika (příbuzná penicilinu), např.
ampicilin
Identifikace bakteriálních kolonií
obsahujících rekombinantní plazmidy
ˇ restrikční analýza plazmidové DNA
ˇ inzerční inaktivace
ˇ alfa-komplementace
Restrikční analýza
ˇ začlenění klonované DNA změní restrikční vzorec
(přítomnost nových restričních míst)
ˇ možno využít pro identifikaci rekombinantích klonů a
ˇ vhodný způsob zjištění orientace klonovaného
fragmentu
Inzerční inaktivace
ˇ fenotypový projev úspěšného začlenění
fragmentu DNA do klonovacího místa v
transformovaných bakteriích
ˇ přímá identifikace kolonií nesoucích
rekombinantní plazmid
Inzerční inaktivace
ˇ klonovací místo je ve vektoru umístěno v
genu zodpovědném za rezistenci hostitelské
buňky k antibiotiku
ˇ inzerce klonované DNA způsobí ztrátu
funkce tohoto genu
ˇ buňky nesoucí rekombinantní plazmid jsou k
danému antibiotiku citlivé, buňky nesoucí
prázdný vektor jsou rezistentní
Alfa-komplementace
ˇ klonovací místo je umístěno v blízkosti 5´konce části genu lacZ
kódujícího -galaktozidázu
ˇ přítomnost klonovacího místa nenarušuje čtecí rámec lacZ, pouze
k tomuto genu přidává několik kodonů, funkce produktu (hydrolýza
laktózy) tím není narušena (modré kolonie na plotnách s
chromogenním substrátem)
ˇ včleněním klonovaného fragmentu DNA do MCS vektoru se přeruší
sekvence lacZ (bbíílléé koloniekolonie na plotnách s chromogenním
substrátem)
ˇ pUC18 nese jen část genu lacZ, zbytek genu poskytuje hostitelská
bakterie (princip komplementace)
Kultivační podmínky pro detekci
aktivity -galaktozidázy v bakteriích
agarové plotny musí obsahovat:
1. substrát X-gal (5-bromo-4-chloro-3-
indolyl--D- galaktozid)
2. induktor IPTG (izopropyl thiogalaktozid)
­ induktor tvorby -galaktozidázy
Princip reakce:
X-gal je bezbarvý substrát, který je -
galaktozidázou konvertován na tmavě modrý
produkt.
Modrá kolonie: plazmid pUC18 je intaktní
BBíílláá koloniekolonie:: plazmid pUC18 má přerušen gen
lacZ, klonování bylo úspěšné
Gen lacZ byl přerušen začleněním klonovaného
fragmentu DNA: na X-gal plotnách vzniknou bbíílléé
koloniekolonie
Výhody alfa-komplementace
Jednoduše poskytuje informace o úspěšnosti
ligace:
ˇ bakterie přijala plazmid (je AmpR)
ˇ bílá barva kolonie signalizuje, že přijatý
plazmid nevznikl recirkularizací prázdného
vektoru
Nevýhody alfa-komplementace
ˇ pokud je inzert malý a nepřerušuje
čtecí rámec, -galaktozidáza může mít
dostatek aktivity pro zmodrání kolonií
ˇ bílá kolonie nemusí vždy znamenat
důsledek úspěšného klonování (delece v
MCS, včlenění nežádoucího úseku
DNA, který poruší čtecí rámec)
Vektory pro speciální účely
ˇ expresní vektory: obsahují promotor,
kterým lze zajistit produkci cizího
proteinu v hostitelských buňkách
(vhodné inducibilní systémy)
ˇ kyvadlové vektory: obsahují dva
počátky replikace ­ možnost propagace
ve dvou různých organismech (např.
E.coli a B. subtilis)
Fágové vektory ­odvozené od
fága Lambda
Výhody:
ˇ rekombinantní DNA lze sbalit do kapsidů a přenést do
hostitelských buněk infekcí (o několik řádů vyšší účinnost
přenosu než při transformaci plazmidovou DNA)
ˇ v jedné zkumavce lze uchovávat ve formě fágových virionů celou
genovou knihovnu (např. několi miliónů rekombinantních klonů)
ˇ vhodné pro klonování větších fragmentů DNA (výhodné pro
tvorbu genových knihoven)
Pozn: rekombinantní plazmidy s velkými inzerty jsou méně stabilní
(nízká klonovací kapacita), transformace je méně účinná, nízký
výtěžek při purifikaci z E. coli
Lysogenní a lytický cyklus
ˇ Lambda je temperovaný bakteriofág (po infekci
E.coli může podstoupit lytický nebo lysogenní
cyklus)
ˇ rozhodují vlivy okolí, genetická charakteristika
hostitele i fága
ˇ existují mutanti fága Lambda podstupující pouze
lytický cyklus (jasné plaky)
ˇ divoký typ poskytuje zakalené plaky (přítomnost
lysogenů rezistentních k další infekci fága:
,,superinfection immunity")
Lysogenie
ˇ exprese téměř všech fágových genů je vypnuta
fágovým represorem (produkt genu cI)
ˇ spontánní represe není absolutní
ˇ reparační mechanismy aktivované poškozením DNA
(UV záření) ničí represor CI (přechod na lytický
cyklus)
ˇ genom Lambda je obvykle integrován do genomu
hostitele místně specifickou rekombinací a spolu s ním
replikován
ˇ genom Lambda může být replikován i v extra-
chromozomálním stavu
Genom fága Lambda
ˇ dvouřetězcová lineární DNA (48.514 bp)
ˇ 12 nespárovaných, ale komplementárních bazí na
obou koncích (lepivé konce)
ˇ párování koncových sekvencí je vzhledem k jejich
délce stabilní i při 37oC
ˇ v infikované buňce se objevuje i kruhová struktura:
důsledek kovalentní vazby katalyzované bakteriální
DNA ligázou
Lepivé konce DNA fága Lambda
Lytický cyklus
ˇ kruhová DNA se nejdříve replikuje obdobně
jako plazmidy: vznik dceřinných kruhových
molekul
ˇ později se replikace přepíná na ,,otáčející
se kruh": vznik dlouhých lineárních molekul
DNA, obsahujících mnoho spojených kopií
genomu Lambda (konkatemery)
Replikace DNA fága
Lambda
Sestavování fágových částic
ˇ exprese fágových genů
ˇ sestavení prázdné fágové hlavy
ˇ sbalení DNA
ˇ připojení bičíku
Sbalení DNA (,,DNA packaging")
ˇ enzymy rozeznávají specifická místa na
molekule DNA obsahující mnoho kopií
fágového genomu (konkatemerů) a
provedou v nich asymetrická štěpení: vznik
lepivých konců (,,cohesive end sites" - cos)
ˇ oblast vymezená 2 místy cos je sbalena a
přenesena do fágové hlavy
Životní cyklus fága Lambda
Lyze bakteriální buňky
ˇ zajištěna produktem fágového genu S
ˇ mutace v genu S způsobuje oddálení nebo
úplné selhání lyze (využívají některé vektory
pro zvýšení výtěžku bakteriofága v důsledku
vícenásobné replikace)
Velikost DNA a kapacita fágové hlavy
ˇ mezi místa cos lze včlenit fragment cizí DNA, ale
celková velikost nesmí překročit 51 kb (cizí DNA
max. 2500 bp)
ˇ kapacitu lze zvětšit odstraněním postradatelných
genů, které zajišťují lysogenní cyklus (min. 37 kb DNA
wt musí být zachováno)
Sbalování DNA in vitro
ˇ přenos fágové DNA do buněk transfekcí je
méně účinný než infekcí (větší velikost než
obvyklé plazmidy)
ˇ fágovou DNA lze účinněji přenést do buněk
prostřednictvím fágových částic, které se
sestaví pomocí sbalovacích extraktů,
obsahujících prekurzory fágových hlav a bičíků
ˇ konkatemerní rekombinantní molekula DNA se
štěpí v místech cos a sbalí do fágových kapsidů
ˇ vytvořenými viriony se infikují hostitelské
buňky E.coli, kde se rekombinantní DNA
pomnoží
Dva typy vektorů odvozených od
fága Lambda
ˇ Inzerční vektory: cizorodá DNA se vkládá do
1 restrikčního místa. Maximální klonovací
kapacita dosahuje cca 13 kb.
ˇ Substituční vektory: cizorodá DNA nahrazuje
střední úsek genomu fágového vektoru, který
je z něj restrikčními endonukleázami před
vložením cizorodé DNA vyštěpen. Klonovací
kapacita se pohybuje od 9 ­ 23 kb.
Inzerční vektory (např. gt10)
ˇ genetickými manipulacemi odstraněny postradatelné
sekvence genomu fága Lambda
ˇ obsahuje unikátní klonovací místo (EcoRI)
ˇ schopnost tvorby životaschopných částic je zachována
ˇ max. klonovací kapacita: 13 kb
Inzerční vektor gt10
ˇ vektor se štěpí EcoRI: vznik 2 fragmentů (pravé a levé rameno)
ˇ ligací se klonovaný fragment vkládá do místa EcoRI
ˇ lepivé konce různých molekul mají tendenci se párovat: tvorba
konkatemerů
ˇ štěpení v místech cos a včlenění rekombinantní DNA do fágových hlav
probíhá při sbalování ,,in vitro": životaschopné fágové částice
ˇ infekce bakterií na misce: tvorba plak
Inzerční inaktivace umožňuje odlišit
rekombinantní vektor gt10 od prázdného
ˇ místo EcoRI je umístěno v genu cI kódujícím
represor
ˇ rekombinantní fág netvoří funkční represor:
neschopnost lysogenie - jasné plaky
ˇˇ parentparentáálnlníí ffáágg: zakalen: zakalenéé plakyplaky
Kmen E.coli hfl usnadňuje identifikaci
rekombinantních fágů
ˇ hfl ,,high frequency of lysogenization"
ˇˇ parentparentáálnlníí ffáágg navozuje lyzogenizaci s vysokou
preferencí: neposkytne žžáádndnéé plakyplaky
ˇ rekombinantní fágy s nefunkčním represorem do
lyzogenního stavu nevstoupí: vzniknou jasné plaky
Substituční vektory
ˇ deriváty fága Lambda
ˇ vyšší klonovací kapacita (až 23 kb)
ˇ využívají přítomnosti sekvencí, které nejsou nezbytné
pro lytický cyklus, ale jejich absence by u inzerčních
vektorů znemožnila tvorbu životaschopných fágových
částic (fágová hlava požaduje určitou minimální
velikost DNA, ale nezáleží na nukleotidové sekvenci)
Vlastnosti substitučního vektoru EMBL4
ˇ 2 klonovací BamHI místa vymezují postradatelný fragment ,,stuffer"
ˇ štěpením se uvolňuje ,,stuffer"+ pravé a levé rameno
ˇ ramena mají tendenci se spojovat (lepivé konce)
Klonování do substitučního vektoru
ˇ štěpení vektoru enzymem BamHI
ˇ oddělení vzniklých fragmentů elektroforézou
ˇ eluce ramen z gelu
ˇ ligace ramen s klonovaným fragmentem, který má
kompatibilní konce
ˇ rekombinantní fágová DNA v podobě konkatemeru
je štěpena in vitro před začleněním do fágových
hlaviček (,,DNA packaging")
ˇ infekce ,,trávníkových" bakterií, tvorba plak
Výhody substitučních vektorů
ˇ preferenčně jsou klonovány větší fragmenty
(pokud je fragment menší než 8 kb nejsou
částice životaschopné)
ˇ defosforylace inzertu: zamezení tvorby většího
počtu tandemově uspořádaných insertů
ˇ rozlišení rekombinantních a prázdných vektorů:
střední fragment může kódovat -galaktozidázu:
plaky původního (nerekombinovaného) fága jsou
modré na médiu obsahujícím X-gal
Kosmidy
ˇ plazmidy, které obsahují místo cos
ˇ spojení výhod plazmidových vektorů a
vektorů odvozených od fága Lambda
Klonování do kosmidů
ˇ štěpení, ligace insertů a purifikace rekombinantních
klonů se provádí stejně jako při práci s plazmidy
ˇ ligační podmínky se nastaví tak, aby byla podporována
tvorba konkatemerů
ˇ místo transformace bakterií se ligační směs podrobí
sbalování in vitro (,,DNA packaging")
ˇ vzniknou fágové částice, které zajistí přenos
rekombinantní DNA do bakterií, ale nejsou
životaschopné (nedochází k tvorbě plak, na kosmidu
nejsou přítomny fágové geny)
ˇ kosmid se bude v bakteriích replikovat jako plazmid
Výhody kosmidů
ˇ klonovací kapacita 30 ­ 44 kb
ˇ možnost propagace a purifikace
konvenčními metodami pro práci s
plasmidy
ˇ přirozená selekce pro velké inzerty
Bakteriofág M13
ˇ vláknitý bakteriofág infikující E.coli
ˇ připojuje se na špičky povrchových výrůstků bakterií
(pilusy), které nesou F-plazmid
ˇ neinfikuje bakterie F-
ˇ dlouhý vláknitý tvar fágové částice
ˇ obsahuje jednořetězcovou kružnicovou molekulu DNA
(6,4 kb)
Replikace bakteriofága M13
ˇ jednořetězcová DNA se uvnitř buňky mění na
dvouřetězcovou DNA (replikační forma - RF)
ˇ RF se replikuje a vytváří kruhovou
jednořetězcovou kopii jednoho vlákna DNA
(důsledek přítomnosti specifického signálu na
jednom řetězci DNA)
ˇ vzniklé vlákno se opět mění na RF nebo se
začleňuje do dceřinných fágových virionů
Tvorba částic fága M13
ˇ při replikaci fágové DNA se v buňce hromadí
mnoho kopií molekul podobných plazmidům
ˇ zároveň se exprimují fágové geny
ˇ fágový protein 5 se váže k ssDNA a
zahajuje její přesun k membráně, kde dojde
k sestavení dceřinných fágových částic
ˇ viriony nezpůsobují lyzi buňky (matné plaky)
Výhody vektorů odvozených od M13
ˇ replikace zahrnuje tvorbu ds DNA, kterou lze z buněk izolovat
jako plazmidovou DNA a dále s ní jako s plazmidem manipulovat
(použít ke klonování)
ˇ významně usnadněno získání ssDNA: do fágových virionů jsou
sbalovány jednořetězcové kružnicové molekuly DNA, které lze
snadno izolovat
ˇ velikost virionu vláknitého fága je určena délkou molekuly DNA:
délka klonované DNA není omezena (lze klonovat fragmenty DNA,
jejichž velikost dosahuje několikanásobku délky fágového genomu)
ˇ infikované buňky jsou viabilní: nevznikají plaky, ale zóny pomaleji
rostoucích buněk jsou viditelné - lze získat fágy o vysokém titru
Klonování ve vektorech M13
Expresní vektory
ˇ upraveny nejen pro klonování DNA, ale také pro její
expresi
ˇ obsahují signály pro:
- iniciaci transkripce (promotor) u transkripčních
fúzních vektorů
- iniciaci transkripce a translace (promotor, RBS a
startovní kodon) u translačních fúzních vektorů
ˇ cizorodá DNA může být přepisována in vitro
na opačných koncích klonovacího místa mohou být umístěny
odlišné promotory: umožnění přepisu obou řetězců inzertu
Využití: hybridizační sondy, translace in vitro
2 typy expresních vektorů
1. Transkripční fúzní vektor
ˇ obsahuje promotor
ˇ translační signály poskytuje klonovaná DNA
2. Translační fúzní vektor
ˇ obsahuje signály pro iniciaci transkripce i
translace
ˇ klonovaný fragment se začleňuje do kódující
oblasti genu ve vektoru
ˇ inzert musí respektovat čtecí rámec
Transkripční fúzní vektor
Translační fúzní vektor
Expresní vektor gt11
ˇ inzerční vektor
ˇ obsahuje klonovací místo EcoRI uvnitř genu -
gal: inzerce fragmentu inaktivuje -
galaktozidázu ­ bílé plaky na médiu X-gal
ˇ pokud je inzert ve správném čtecím rámci,
vznikne proteinová chiméra ­ produkt fúze
klonovaného genu a -gal
ˇ protein je možno detekovat protilátkou
Proteinová chiméra tvořená z vektoru gt11
Inducibilita exprese
ˇ nežádoucí exprese z neindukovaných
promotorů limituje klonování, pokud
je produkt klonovaného genu toxický
ˇ výhodný je promotor fága T7: není
rozeznán RNA polymerázou E. coli
Využití expresních vektorů
Postup:
ˇ klonování fragmentu DNA do vektoru pod kontrolu
promotoru T7
ˇ přenesení plazmidu do kmene E. coli, který obsahuje
gen pro T7 RNA polymerázu pod kontrolou lac
promotoru
ˇ exprese T7 RNA polymerázy je inducibilní IPTG,
částečná ,,netěsnost" neindukovaného promotoru lac
se řeší přidáním inhibitorů
ˇ T7 RNA polymeráza zajistí expresi klonovaného genu
Vektory pGEM
- expresní vektory
- MCS je obklopeno dvěma opačně orientovanými
fágovými promotory (T7 a SP6)
- možno snadno získat ,,sense" a ,,antisense" transkript
klonovaného genu
Vektory pro klonování a expresi v
eukaryotických buňkách
ˇ primární klonování se provádí v bakteriích E. coli,
následuje přenos do eukaryotických buněk
ˇ v eukaryotických buňkách se často sleduje funkce
genu, interakce jeho produktu s jinými proteiny, atd.
ˇ větší důraz na expresi daného genu než na tvorbu
genových knihoven (výjimka: vektory YAC)
Kvasinkové epizomální vektory
Založené na existenci přirozených kvasinkových
plazmidů 2 m
- samostatná replikace v kvasinkách
- vysoký počet kopií v buňce (25-100)
- obsahují místo ori pro replikaci v E.coli
- selekce založena na komplementaci auxotrofních
mutací hostitelského kmene např. v genech trp1,
ura3, leu2, his3 (z důvodu nedostatku antibiotik,
ke které jsou kvasinky citlivé)
- nesou marker pro rezistenci k antibiotiku pro
selekci v E.coli
Kvasinkový epizomální vektor
Nevýhoda kvasinkových epizomálních
vektorů
ˇ nízká stabilita v kvasinkových buňkách
plynoucí z občasné chybné segregace
při mitóze
Kvasinkové centromerové vektory
ˇ obsahují kvasinkový počátek replikace ars ,,autonomně
se replikující sekvenci"
ˇ obsahují centromeru
ˇ nízký počet kopií v buňce (1-2): výhodné např. pokud je
studovaný protein pro buňky škodlivý
Expresní kvasinkové vektory
ˇ většina kvasinkových vektorů má zajišťovat expresi
klonované sekvence
ˇ obdoba bakteriálních vektorů, signály pro expresi
musí respektovat kvasinku jako hostitelský
organismus
- promotory srozumitelné kvasinkám
- signály pro sekreci
- signály pro transport do určitých buněčných
kompartmentů
ˇ nejsou vhodné pro zajištění excize intronů
Kvasinkový integrační plazmid (Yip)
ˇ neschopen samostatné replikace
ˇ integruje se do chromozomu homologní rekombinací
ˇ nízká účinnost transformace
ˇ obtížné získání rekombinantního vektoru po
transformaci
ˇ výrazně vyšší stabilita než u autonomně se
replikujících plazmidů
Kvasinkový integrační plazmid (Yip)
Umělý kvasinkový chromozom (YAC)
Obsahuje:
ˇ 2 kvasinkové telomery, které umožňují jeho udržování v
kvasinkách v lineární podobě
ˇ centromeru
ˇ sekvence pro replikaci
ˇ selektovatelné signální znaky
ˇ replikuje se v buňkách E.coli i kvasinkách (kyvadlový vektor)
ˇ vhodný pro klonování velkých fragmentů DNA (0,2 ­ 2 Mb)
Klonování v YAC
ˇ propagace v E. coli
ˇ odstranění vyplňovacího fragmentu mezi telomerami
(,,stuffer") restrikčním štěpením
ˇ vznikají dvě lineární ramena nesoucí selekční markery
ˇ ligace insertu mezi ramena (podobně jako u fága
Lambda)
ˇ transformace kvasinkových buněk (sféroplastů)
ˇ selekce založená na komplementaci auxotrofních
markerů (rekombinanti obsahují obě ramena)
ˇ sekvence tel v transformantech zajistí tvorbu
funkčních telomer
YAC
Výhody:
ˇ vysoká klonovací kapacita
- lze klonovat celé eukaryotické geny, včetně
regulačních sekvencí
Nevýhody:
ˇ nižší stabilita inzertu (možnost vnitřní rekombinace)
ˇ obtížná purifikace
Klonování
genů v YAC
PAC a BAC
ˇ bakteriální vektory s nižší klonovací kapacitou
než YAC
ˇ PAC = umělý chromozom odvozený od
bakteriofága P1, který pojme inserty o velikosti
kolem 150 kb
ˇ BAC = vektor založený na F plazmidu, který
pojme inserty až do velikosti 300 kb
ˇ výrazně vyšší stabilita než YAC
ˇ hojně používané u sekvenačních projektů
Vektory pro savčí buňky
ˇ replikace extrachromozomálních elementů
typu plazmidů je v savčích buňkách obtížná
ˇ vektory s počátkem replikace viru SV40 se
replikují epizomálně v některých savčích
buňkách (např. v buňkách COS)
ˇ stabilní klony většinou vznikají po začlenění
DNA do chromozomu
Vektory pro savčí buňky
Obsahují signály, které savčí buňka vyžaduje pro zajištění
genové exprese:
- obvykle odvozeny od virů (SV40, CMV)
- promotor (např. CMV) (vysoká konstitutivní exprese)
- polyadenylační signál (zvýšení stability mRNA)
- počátek replikace ori (např. SV40)
- počátek replikace E. coli
- bakteriální selekční marker (bla)
- selekční marker pro savčí buňky neo (rezistence na
antibiotikum G418 ­ geneticin)
Vektory pro savčí buňky
Retrovirové vektory
ˇ využití schopnosti retrovirů zajistit integraci DNA
do genomu
ˇ využití možnosti ,,trans" komplementace
retrovirových funkcí defektním pomocným (,,helper")
virem
ˇ funkce, které nelze ,,trans" komplementovat, musí
být přítomny na samotném vektoru (LTR a místo psi)
Retroviry
ˇ RNA genom
ˇ v infikované buňce se RNA kopíruje do dvouřetězcové DNA
zpětnou transkriptázou
ˇ zpětná transkriptáza je obsažena ve virionu a vstupuje do
buňky zároveň s RNA
ˇ DNA se cirkularizuje a integruje do DNA hostitelské buňky
působením integrázy
ˇ integrovaná DNA je ohraničena sekvencemi LTR
ˇ LTR obsahuje promotor pro transkripci genů gag, pol, env
ˇ transkripty se sbalují do virových částic pomocí domény psi
ˇ sestavené částice pučí ven z buňky, aniž ji lyzují a získávají
tak glykoproteiny z hostitelské buněčné membrány
Klonování do retrovirových vektorů
ˇ využití možnosti propagace v E. coli ­ vytvoření rekombinantní
verze plazmidu a její namnožení v bakteriích
ˇ transfekce speciální buněčné linie (,,helper cells"), která ve
svém genomu obsahuje geny gag, pol a env
ˇ transfekované buňky budou tvořit viriony obsahující RNA
kopii vytvořeného konstruktu
ˇ virové částice mohou infikovat jiné buňky, které neobsahují
integrované esenciální geny
ˇ přítomnost zpětné trankriptázy a integrázy ve virionech
zajistí konverzi RNA do DNA a její stabilní integraci do
genomu
ˇ další viriony se nevytvoří
Klonovací kapacita vektorů
0.2 ­ 2.0 MbYAC vektory
300 kbBAC vektory
130-150kbPAC vektory
30-44 kbKosmidové vektory
9-23 kb Substituční vektory
0-10 kb Inzerční vektory
0-10 kbBěžné plazmidové
vektory
Velikost inzertuKlonovací vektor