Genová knihovna (genová banka)
ˇ soubor náhodně klonovaných fragmentů genomové
DNA příslušného organismu
ˇ základ klonovacích strategií
ˇ nutná pro vyhledání a klonování určitého genu
Klasifikace
Podle původu DNA:
ˇ genomová knihovna - soubor klonovaných fragmentů vzniklých
štěpením genomové DNA, které reprezentují celý genom organismu
ˇ knihovna cDNA - soubor klonů cDNA, které byly připraveny zpětnou
transkripcí mRNA a v podobě cDNA tak reprezentují transkriptom
daného organismu/tkáně/buňky v daném čase
ˇ knihovny cDNA připravené z různých tkání téhož organismu jsou
odlišné
ˇ expresní knihovna - knihovna cDNA vytvořená expresními vektory
- klonované sekvence mohou být exprimovány
Genomová knihovna
Příprava:
ˇ izolace genomové DNA
ˇ fragmentace na části o vhodné velikosti
(restrikční endonukleázy)
ˇ klonování fragmentů do vhodného vektoru
ˇ u vektorů Lambda, nebo kosmidů: ligační
směs se smísí se sbalovacími extrakty
ˇ u plazmidových vektorů: ligační směs se
použije k transformaci bakterií
ˇ knihovna má podobu transformovaných
bakterií nebo fágových částic
ˇ identifikace klonu obsahujícího studovaný
fragment
Uchování knihovny
ˇ zamražení bakteriální
suspenze vytvořené ze
smíchaných kolonií nebo
fágového lyzátu vytvořeného
ze směsi plaků
ˇ knihovna je smícháním
původních jednotlivých
transformantů nebo fágových
virionů amplifikována: každý
klon je v amplifikované
knihovně zastoupen v mnoha
kopiích
Výhody a nevýhody
Knihovna cDNA:
ˇ menší velikost (neobsahuje
introny, regulační sekvence,
nepřepisované oblasti)
ˇ snadnější prohledávání
ˇ možnost sledování změn
genové exprese souvisejících
s genetickými chorobami,
rakovinou, diferenciací, atd.
Genomová knihovna:
ˇ větší velikost
ˇ umožňuje studium genů v
přirozené podobě, včetně
intronů a regulačních
sekvencí
ˇ nutná pro fyzikální analýzu
genomu
Velikost knihovny
ˇ udává minimální počet klonů postačující pro zachycení
celého genomu
Závisí na:
ˇ velikosti genomu
ˇ velikosti inzertu, který lze začlenit do daného vektoru
(klonovací kapacitě vektoru)
Příklad výpočtu počtu klonů nutných pro
vytvoření úplné genové knihovny
Zjednodušeně:
Velikost genomu = 4 Mb (4x106 b)
Velikost fragmentů = 4 kb (4x103 b)
Počet klonů = 1000
Možné jen za předpokladu, že
a) všechny klony jsou odlišné
b) klony se nepřekrývají
Výpočet počtu klonů nutných pro
vytvoření úplné genové knihovny
ˇ není možné zajistit, aby daná knihovna obsahovala
úplnou genetickou informaci daného genomu se 100%
pravděpodobností
ˇ se zvyšujícím se počtem klonů se zmenšuje
pravděpodobnost, že další klon přinese novou
informaci (redundance)
ˇ matematicky lze stanovit, s jakou pravděpodobností
se daný gen v knihovně vyskytuje
Výpočet počtu nezávislých klonů nutných
pro vytvoření úplné genové knihovny
N = ln(1 - P) / ln(1 - F)
N = počet klonů
P = pravděpodobnost, že knihovna obsahuje žádaný
fragment DNA
F = frakce genomu reprezentovaná průměrným
klonem (podíl průměrné velikosti inzertu a celkové
velikosti genomu)
4,6 x 1040,99300 kbBAC
3,5 x 1050,9940 kbKosmid
7,7 x 1050,9918 kb subst
3,5 x 1060,994 kbPlazmid3 x 109Savec
590,99300 kbBAC
4580,9940 kbKosmid
1,0 x 1030,9918 kb subst
4,6 x 1030,994 kbPlazmid4 x 106Bakterie
Velikost
knihovny
PVelikost
inzertu
(kb)
VektorVelikost
genomu
(b)
Organismus
Odhad velikosti genových knihoven
Ověření kvality knihovny
Otázky:
ˇ jaká je proporce klonů, které obsahují inzert?
ˇ jaká je velikost klonovaných inzertů?
Odpovědi:
ˇ namnožení jednotlivých klonů, extrakce plazmidové
nebo fágové DNA, restrikční analýza, gelová
elektroforéza
ˇ využití ,,modro-bílého" testu
Ověření
kvality
knihovny
Vyhledávání genů v knihovně
Hledání klonů nesoucích studované sekvence.
Obvykle založeno na hybridizacích se sondami DNA
třech typů:
ˇ cDNA připravené z mRNA tkáně, ve které dochází k
silné expresi daného genu
ˇ sekvence DNA genu příbuzného organismu
ˇ synteticky připravené oligonukleotidy odvozené ze
sekvence aminokyselin proteinu
Je-li znám proteinový produkt, je možno pro detekci
hledaného klonu použít protilátek.
Problémy spojené s tvorbou
genových knihoven
ˇ nestejná velikost fragmentů: rozdílná
pravděpodobnost jejich začlenění do vektoru
ˇ omezená klonovací kapacita vektorů
neumožňuje charakterizaci dostatečně
dlouhých úseků DNA
Procházení po chromozomu
Cíl:
ˇ vyhledání klonů, které nesou překrývající a na sebe
navazující inserty
ˇ uspořádáním těchto klonů lze získat informaci o
spojité sekvenci v určité oblasti genomu
Předpoklad:
ˇ z předchozí genetické analýzy je přibližně známa
oblast genomu, v níž se hledaný gen nebo sekvence
nachází
ˇ jsou k dispozici sekvence okolních oblastí, které
slouží jako výchozí body pro procházení
Procházení po chromozomu - postup
ˇ sondou se vyhledá klon nesoucí již dříve
charakterizovaný úsek genomu
ˇ z koncových částí inzertu takto nalezeného klonu
jsou připraveny sondy, kterými je genová knihovna
znovu prohledána, atd.
ˇ opakováním tohoto postupu se získá informace o
souvislé sekvenci, která má začátek v
charakterizovaném úseku genomu a končí v oblasti
vzdálené stovky kilobází
,,Chromosome walking"
Srovnání knihoven překrývajících a
nepřekrývajících se fragmentů DNA
Částečné štěpení DNA (,,partial digest")
Přerušení DNA jen v některých z cílových míst pro daný
restrikční enzym.
Možné experimentální přístupy:
ˇ zkrácený reakční čas
ˇ nižší počet jednotek enzymu
ˇ snížená inkubační teplota
Částečné štěpení DNA pro přípravu
překrývajících se fragmentů
Přeskakování po chromozomu
Cíl:
překlenutí chybějících mezer v sekvencích genomové
DNA (doplněk k technologii procházení chromozomu)
Princip:
ˇ příprava knihovny pro přeskakování, která obsahuje
přeskakovací klony
ˇ přeskakovací klony nesou nesousedící sekvence ze
vzdálených oblastí genomu
Přeskakování po chromozomu - postup
ˇ částečným štěpením genomové DNA se vytvoří velké fragmenty,
které se rozdělí pulzní gelovou elektroforézou
ˇ izolace fragmentů o velikosti 50-200 kb
ˇ spojením konců fragmentů DNA ligázou se vytvoří kružnicové
molekuly ­ v nich se původně vzdálené sekvence objeví v těsné
blízkosti
ˇ štěpením kružnicových molekul DNA jinou restriktázou vzniknou
fragmenty, z nichž část ponese spojené konce původních
fragmentů
ˇ tato spojení jsou klonována do fágového vektoru za účelem
založení knihovny pro přeskakování
Přeskakování po chromozomu - postup
ˇ z počátečního úseku studované DNA se připraví sonda, která se
použije k vyhledání přeskakovacího klonu
ˇ jakmile je klon nalezen, použije se druhý konec jeho inzertu k
přípravě sondy, kterou lze zahájit procházení po chromozomu oběma
směry