Polymerazova řetězová reakce PCR (Polymerase Chain Reaction) i Princip PCR ■ Zavedení PCR v roce 1983 (Kary Mullis) ♦ Publikace ♦ Nobelova cena ■ Metoda pro mnohonásobné zmnožení (amplifikaci) specifického úseku DNA in vitro založená na principu replikace. ■ K opakující se enzymové syntéze komplementárních řetězců vybraných úseků dvouřetězcové DNA dochází po připojení dvou primem vázajících se na protilehlé řetězce DNA tak, že jejich 3'-OH-konce směřují proti sobě. ■ PCR umožňuje získat požadovanou zcela specifickou sekvenci bez klonování. 2 ■ PCR využívá základních rysů replikace (enzymatické syntézy) DNA: ♦ Jako templát slouží ssDNA, podle níž je syntetizován komplementární řetězec. ♦ K zahájení reakce je zapotřebí primer, který se připojuje na komplementární úseky DNA. Tím je zároveň vymezen úsek DNA, který bude amplifikován. ♦ Jako templaty pro syntézu mohou sloužit oba řetězce dsDNA, po předchozí denaturaci. ■ Primery se vybírají tak, aby se připojovaly k místům ohraničujícím z obou stran amplifikovaný úsek. ■ Teoreticky lze získat 2n řetězců (kopií). ■ Předpoklady pro zavedení PCR ♦ Syntéza oligonukleotidů ♦ Vlastní myšlenka (K. Mullis) ♦ Teplotně stabilní DNA polymeráza ♦ Automatické termocyklery Replikace DNA in vivo vyžaduje mnoho enzymů tem plát vedoucího řetězce nově syntetizovaný řetězec sví raci protein DNA-polymeráza na vedoucím řetězci VEDOUCÍ ňETĚZEC rodičovská DNA nový Okazakiho fragment vS&Č9 4T DNA-helikáza RNA-primer primáza vazebný protein pro jednoduchý řetězec templát pro váznoucí řetězec DNA-polymeráza na váznoucím řetězci (právě dokončuje syntézu Okazakiho fragmentu) Replikace DNA in vitro vyžaduje pouze jeden enzym ■ Reakční směs obsahuje: ♦ Templátovou nukleovou kyselinu (DNA nebo RNA). ♦ Množství DNA jako výchozího materiálu je velmi nízké: obvykle postačuje méně než 1 jig genomové DNA, teoreticky postačuje jedna molekula. • Kvalita templátu ovlivňuje výsledek PCR. • Velké množství RNA může vázat ionty Mg2+ • znečištěný templát může obsahovat inhibitory PCR ♦ Zdroj: mikroorganizmy, buňky z tkáňových kultur, tělní tekutiny, bioptické vzorky, stery, vlasy, atd... ■ Primery. Chemicky syntetické ologonukleotidy o velikost 10-30 nukleotidů. ■ dNTP ve formě Na+ nebo Li+ solí ■ Mg2+ ionty tvoří rozpustný komplex s dNTP a vytvářejí substrát, který rozpoznává DNA polymeráza. ■ Termostabilní DNA polymerazu, která odolává teplotám až 98 °C. ♦ Taq Thermus aquaticus ♦ Tth Thermus thermophilus ♦ Tma Thermotoga maritima ♦ Pfu Pyrococcus furiosus ♦ Pwo Pyrococcus woesei 5 Syntéza obou řetězců u specifické sekvence 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' I 5' Přímý primer üntps 5' 3' ^__~y TTGAGAAAGGAATAAGC J JNA P01 AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC *--(dnapol)- TCTTTAGCTCATATACG >—Jy 5' dNTPs Zpětný primer 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG 3' 5' 5' 3' TTGAGAAAGGAATAAGCAGAATTCGTTCCAAAAAGAATGAGCTGTTGTTTGCAGAAATCGAGTATATGC AACTCTTTCCTTATTCGTCTTAAGCAAGGTTTTTCTTACTCGACAACAAACGTCTTTAGCTCATATACG i REAKČNÍ PODMÍNKY PCR 1. Počáteční denaturace DNA. Důležitá je kompletní denaturace templátu, obvykle postačuje zahřátí směsi na 2 - 5 min / 95 °C. V případě, že dojde pouze k částečné denaturaci, molekuly DNA velice rychle renaturují a to vede k nespecifické vazbě primem („self-priming") a možným falešným výsledkům. Vlastní řetězová reakce:______________________________________________ 2. Denaturační krok (separace řetězců) : 94 - 95 °C / 20 - 45 s, záleží na objemu reakce, tloušťce stěn zkumavek. Nedostatečně denaturovaná DNA neumožňuje přístup primerům, naopak příliš dlouhá denaturace snižuje aktivitu DNA polymerázy (stabilní cca 2 hod / 98 °C). 3. Připojení primem (55 - 65 °C / 30 - 90 s) teplota určuje specifičnost a [)x závisí na Trn primeru a templátu. Pro oba primery by měla být Trn podobná. Ta se optimalizuje v teplotním gradientu nebo se stanovuje empiricky. 4. Prodlužování primeru (polymerační reakce) při standardní PCR probíhá při 72 °C /45 - 90 s. Taq DNA polymeráza syntetizuje DNA při této teplotě rychlostí cca 60 bází/s. Nově syntetizované řetězce slouží jako templáty pro další cyklus. Cyklické střídání teplot jednou založené směsi zajišťuje průběh reakce PCR, provádí se v termocyklerech, většinou se provádí 25 - 35 cyklů. 5. Závěrečná extenze se provádí obvykle po posledním cyklu (72°C / 5 min) a slouží k dokončení syntézy a renaturaci jednořetězcových produktů. 7 REAKČNÍ PODMÍNKY PCR Denaturace vzorku DNA Pro oddělení jednořetězců (94 °C, 5 min) Připojení primem na řetězce DNA 30-65°C, 1 min; Denaturace pro separaci řetězců DNA (94 °C, 30 s) 25 - 35 * Syntéza nových řetězců DNA polymerázou (72 °C, 45s - 2 min) START a G A T G ■.i.i.i.i.i.iM.DNAFRAGMENT C G T A A T G G A ■ti/4 A A PRIMERS T + i i i ,4^ DNA POLYMERASE BASES C Vi A A Ar C C G Pcr.exe C G A (A) C ZAHŘÁTÍ :! K ODDĚLENÍ dvoušroubovice -DNA \ 1. krok HYBRIDIZACE PŘÍMĚRŮ H—Ľ 2. krok první cyklus +DNA polymerAZa +dATP +dGTP +dCTP +dTTP L_ syntéza DNA z primerů 3. krok (B) ■I ■I L oddělení řetěxců DNA a přidání primem oddělení syntéza řetězců DNA a svázání DNA oddělení syntéza s prjmerem * řetězců DNA a svázání DNA ^g^^^^^^^g ^g^^^^^^^ s primerem / \ZI ~*"i i \ syntéza ^^^^^ ■ —■ m DNA / \ xr =sp \ cín j DNA-oligonukleotidové primery oblast dvou řetězcové chromosomální DNA, kterou množíme xn \. V i=c =sp X xn^xr xn ■^p CIL 3P \ I ,/ ^X / XD XT J XU 3P XU ^v ^ V cx ^Zl *| I ^ =^ ^ atd. N Počet nove syntetizovaných molekul dsDNA při jednotlivých cyklech PCR 2n-1 KONCENTRACE JEDNOTLIVÝCH SLOŽEK PŘI STANDARNÍ PCR REAKCI ■ DNA. Pro standardní PCR se doporučuje následující množství DNA podle velikosti templátu: ♦ lidská genomová DNA: 100 - 500 ng ♦ bakteriální DNA: 1 - 10 ng ♦ plazmidová DNA: 0,1 - 1 ng ■ Primery. Sekvence a koncentrace primeru významně ovlivňuje výsledek PCR. ♦ Optimální koncentrace je mezi 0,1 a 0,6 |jM. ♦ U některých systémů může vyšší koncentrace (až 1 |jM) zlepšit výsledky. ♦ Nižší koncentrace vede k předčasnému vyčerpání primem a snížení výtěžku. ■ dNTP. Výsledná koncentrace se může pohybovat v rozmezí 50 - 500 |jM (pro každý nukleotid) ♦ Nejběžnější koncentrace dNTP je 200 |jM. Při zvýšení koncentrace dNTP je třeba zvýšit koncentraci Mg2+ iontů. MgCI2. Volné Mg2+ ionty ovlivňují aktivitu enzymu a zvyšují hodnotu T„ u dsDNA. m ♦ Pro dosažení nejlepšího výsledku vždy stanovujeme koncentraci Mg2+ experimentálně. ♦ Optimální koncentrace může kolísat od 1 mM do 5 mM. ♦ Nejčasteji používaná koncentrace je 1,5 mM (pro 200 |jM dNTP). CM CM CM 2 ^ S £ £ *— (0 £ £ £ £ tn o io| o 10 o u> o t- ■> Q_ M CM co co 12 ■ DNA polymeráza. ♦ Obvyklá koncentrace je 0,5 - 2,5 jednotek / 50 |j|. ■ pH je dané reakčním pufrem, obvykle odpovídá pH 8,3 - 9,0. ■ Přídatné látky mohou v některých případech ovlivnit účinnost a specifičnost PCR reakce. Jejich vliv se obvykle určuje experimentálně: ♦ albumin z bovinního séra (BSA) (100 ng/50 |jl) ♦ dimetylsulfoxid (DMSO) (2-10 % v/v) - redukce nespecifické vazby primem ♦ detergenty (Triton X-100, Tween 20) ♦ betain (0,5 - 2 M) ♦ želatina ♦ glycerol (1 - 5 % v/v) ♦ spermidin ♦ protein 32 genu fága T4 ■ Minerální olej - zabraňuje vypařování během reakce 13 Struktura Taq DNA polymerázy prsty" dNTP palec" S'-Exonukleáza 14 BEZCHYBNOST SYNTÉZY Replikace s Taq DNA-polymerázou neprobíhá bezchybně, DNA-polymeráza příležitostně zařazuje do nově syntetizovaných řetězců chybné (nekomplementární) nukleotidy. ♦ Buňka má schopnost tyto báze odstraňovat opravnými mechanizmy. ♦ In vitro Taq DNA-polymeráze tato vlastnost chybí. Frekvence chbného začleňování za podmínek amplifikace in vitro je asi 2x10"4. Chybné začleňování je důležité, pokud jsou PCR produkty klonovány, neboť každý klon je odvozen z jedné molekuly DNA. Chybně začleněné báze . , x , ii- ■* misincorporation of nucleotides J proofreading polymerase {PwoJ (mUtaCe) pOtOm ObSahUje byTaqDNApoI vmj^vUiHavanM celé potomstvo. Řešení problému: použití dvojice DNA polymeráz, ^r ^ Z nichŽ Jedna má OOrSVné ^ leading to truncated PCR products J PCR products can be completed mechanizmy (proofreading). ■ J______ K J 0 15 Základni optimalizace PCR Složka Nižší stringence Vyšší stringence Teplota pro připojení primem i t MgCI2 t i KCl t i Enzym, Primer t i Formamid i t ■ Zpravidla se optimalizuje ♦ Teplota pro připojení primem v termocykleru s teplotním gradientem ♦ Koncentrace MgCL Stanovení teploty pro připojení primem Teplota pro připojení primem (annealing temperature) zkr. Ta. Teplota používaná pro teplotní hybridizaci molekul primem a matricové DNA in vitro. Optimální teplota pro připojení primem při PCR se vypočítá podle vztahu: T = 0,3 x rPrimer + 0,7 x rProdukt - 25 kde Tm Primer je hodnota Tm nejméně stabilního páru primer-matrice a Tm Produkt je hodnota Tm amplifikačního produktu. Orientačně lze vypočítat Ta podle vztahu: Ta = 2(A+T) + 4(G+C) - 5 °C = Tm - 5 °C 17 Hodnota Tm Tm závisí na třech základních faktorech: ♦ Zastoupení bází ♦ Složení roztoku ♦ Koncentrace solí ♦ pH ♦ Délka molekuly DNA 100 c a) o v. O) a v o £ CD C w o > u + c c CD O) T~ (°C) m 18 NÁVRH PRIMERŮ PRO STANDARDNÍ PCR ♦ 18-25 bází dlouhé ♦ neobsahují vnitřní sekundární struktury ♦ obsahují 40- 60 % G+C ♦ mají rovnoměrnou distribuci oblastí bohatých na G/C a A/T páry ♦ nejsou komplementární navzájem na 3'-koncích, takže nevytvářejí navzájem nebo samy se sebou duplexy ♦ na matricové DNA nemají falešná vazebná místa ♦ mají Tm teplotu 55 - 65 °C Pro návrh primem se obvykle používá specializovaný software (některý je volně dostupný na internetu). Melting Tempera ture [21-mer] PUC19.SEQ Graph Zoom Options Tm RUSUHTUK" gjtjg! i Dor dfeplay mode (2686) |pos:| 2C. |Tm:| 64~ |50 |40 ~[5 rtocecGi i___■____i ■ ■■. '.■ ■■ ■ a :iGGGÍ.GCflflflGCCflCTflCTGCCflCTTT"GGflGBG' .■"ŕXr.'-.-.TCKäCCHu -GTGTfiCGTCGflGGGCCTCTGC Bar graph mode "FFR n i Lower Primer False Priming Sites HB Lover Primer - M13MP18:6310L19 (positive strand) Priming efficiency cf the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 428 (above the threshold) 5-(6320) GGTTTTCCCHCrCflCGHCG ÍĚ310)3- „ II II I II III III III II , 3"(fc328) ccaaaagggtcagtgctgc (6310)5" Priming efficiency : 205 (above the threshold) 5"(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGflCG (6310)3' III MM MIHI 3"(626) agcaaatggtc—tgctgc (610)5" Priming efficiency : i 94 (above the threshold) 5"(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGflCG i6310)3" , , :. I lllllll Mil ■ 3"(8U8) gtaatatggtcagtcctgc (790)5" Priming efficiency : 185 (above the threshold) 5"(6328) GGTTTTCCCflGTCflCGflCG >6310)3" III llllllll III 3"(5125J tctaagtggtcagtg-tgc (5108)5" Priming efficiency: 121 .'.-:>■ ■ GGTTTTC-CCHGTCflCGPCC- Mill MM I MM 3"(5989) agaaaagiggtc-gctctgc (5971)5" Lover Primer - Ml 3MP18:631ÜL19 (negative strand) Priming efficiency of the perfect match is 428 (above the threshold) Priming efficiency : 76 5(6328) GGTTTTCCCnGTCflCGnCG (6310)3" lllllll Mil 3"(5744) ccaaaaagcgggaaactgc (5762)5" Sequence Length: 1842 CCCGCCTGATGAATGCTCATC 3- -42.7 kcal /mo I Current Oligo- B pCBIu3-seq 492 5.30 nmol/Avf.O 34.0 /ig/A2&0 Current Oligo (- strand) 5' GATGAGCATTCATCAGGCGGG 3' P.E.*: 537 4.80 nmol/Avf.O 31.7 rg/A2&0 G = Selected Primers__ B pCBly . .'nper Primer 5' CGGCGCCAGATCTGGTACCCA 3' Length: 21-mer 5" Position: 2Ě9 Tm: 7Ě.9°C AG (25 °C): -46.1 kcal/mol Degeneracy: 1 P.E.*: 542/542 , 5.12 nmol/A2£0 33.1 /ig/A2&o pCBIu3:817L21 Lower Primer 5' TACCGGGTTGGACTCAAGACG 3' Length: 21-mer 3" Position: 817 Tm: 69.5 °C AG (25 °C): -41 4 kcal/mol Degeneracy: 1 P.E.*: 502/502 4.89 nmol/A260 32.0 /*g/A2&o pCBlu.seq -- " Optimal Annealing Temperature: 58.3° (Max: 72.0°) Product Tm - Upper Primer Tm: 15.S Primers Tm difference: 7.6 Concentration Upper Primer Lover Primer Monovalent Cation Free Mg[2+] 200.0 nM nH mM niM 200.0 50.0 0.7 Terminal stability of the Lower Primer is toe high. Position and Length Tm [°C] GC [?E] P.E.» Product Upper Primer Lover Primer 1352 88.0 72.2 79.9 51.3 47.6 57.1 452 506 37 1368 21 21 Total Ha[+] Equivalent: 155.8 20 príklady struktur vytvářených primery, které je nutné zohlednit při jejich návrhu ■ Chybně navržená dvojice primerů, která vytváří stabilní duplex na 3'-konci: 5' ATTCAACCGTTCAAACAAGCCC 31 31 GTTCGGCCTACCTTTATTTCTC 51 ■ Správně navržená dvojice primerů, která vytváří pouze málo stabilní duplex na 5'-konci; na 3'-konci je G nebo C zaručující stabilní párování s templátem: 51 CGAAATAAGACTAGTAAAGC 31 I I I I I I I 31 CCTTACTCCACGCCTAATACAATCC 51 Chybně navržený primer, vytvářející vlásenku 51 TTTTTCAAGG-, III C S'AAAAGAGAT^ Nesprávně navržený primer s falešnými vazebnými místy na templátové DNA: 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II I I I I I I I I I I I I 3'(948)tttcttacccttttt-tacc(966)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' II II I II I I I I I I 3'(1191)tttgtattgcattatatacc(1210)5' 5'(1029) AAGGCTAGAGAAAAATATGG (1048)3' I I I I I I I I I I I I 3'(395) tec atttttctttttatctt (414)5' Správně navržený primer, který nemá falešná vazebná místa na templátu: 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I III 3'(787) taaatctattagtttacacataacc (811)5' 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I INI 3'(3211)caattgtaactataactgcgttatc (3235)5' 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I II I I I I II I 3'(1194)gtattgcattatatacctctgttag (1218)5' 5'(2476) CCTAACATAATCCGCACCTCATTCC (2452)3' I I I I I I I I II I 3'(1469) atattgta-tatacgaactaaatct (1492)5' „HOT START" PCR ■ „Hot-start" PCR významně ovlivňuje specifičnost, citlivost a výtěžek reakce ■ Princip: ♦ Při „hot-start" PCR jsou určité složky reakční směsi odděleny od ostatních, dokud teplota ve zkumavce nepřekročí optimální teplotu pro připojení primem (obvykle 55 °- 65 °C). ♦ DNA polymeraza je v této nekompletní reakční směsi nefunkční. ♦ Nedochází k prodlužování nespecificky navázaných primerů během doby než je dosažena teplota Ta. ■ Separace důležitých složek reakční směsi je dosažena některým z následujících způsobů: ♦ Manuálně ♦ Některé složky jako DNA polymeraza nebo Mg2+jsou vynechány v původní reakční směsi a přidány manuálně po dosažení teploty > 70 °C. Nevýhodou je možnost kontaminace a možná ztráta reprodukovatelnosti. ♦ Fyzikální separace ♦ Reakční komponenty jsou rozděleny do dvou směsí, které jsou odděleny bariérou (vosková přepážka, nebo voskové korálky obsahující MgCI2). Během počáteční denaturace vosk roztaje a umožní smíchání reakčních složek. ♦ Protilátky proti DNA polymeráze ♦ Přídavek teplotně nestabilních protilátek umožní počáteční inaktivaci polymerázy. ♦ Chemická modifikace polymerázy ♦ Přídavek teplotně nestabilních látek, které se vážou na určité aminokyselinové zbytky blokují enzym (ten je potom při pokojové teplotě inaktivní). K aktivaci enzymu dochází při počáteční denaturaci („FastStart Taq DNA polymeraza"). ♦ Další inhibitory ♦ např. oligonukleotidy specificky se vázající na polymerázu DETEKCE AMPLIFIKOVANEHO PRODUKTU PCR Stanovení fyzikální velikosti produktu gelovou elektroforézou (agaróza, polyakrylamid). Detekce obarvením a pozorování pod U V světlem. Štěpení produktu restrikcními enzymy a posouzení spektra vznikajících restrikčních fragmentů (PCR-RFLP) Elektroforetická separace produktů za specifických podmínek pro detekci sekvenčních polymorfizmu ♦ DGGE - denaturační gradientova gelová elektroforéza ♦ SSCP - analýza polymorfizmu konformace jednořetězcových forem Příklad standardní gelové elektroforézy s produkty PCR v agarózovém gelu. 1 = hmotnostní st. 2 - 4 = produkty PCR 2 3 4 25 DETEKCE AMPLIFIKOVANEHO PRODUKTU PCR 4. hybridizací s neradioaktivně značenou sondou komplementární k části sekvence amplifikovaného úseku a detekcí enzymoimunoanalýzou v mikrotitrační destičce (PCR-EIA/ELISA), hybridizační sonda může být následně amplifikována (PCR-OLA) 5. imobilizací PCR-produktů na membráně a tečkovou hybridizací se značenými alelově-specifickými oligonukleotidy (ASO) nebo zpětnou tečkovou hybridizací s různými ASO imobilizovanými na membráně, 6. hybridizací na DNA-čipech, 7. stanovením sekvence DNA. Kontaminace pri PCR ■ Vynikající citlivost PCR může být ovlivněna kontaminací i jedinou molekulou exogénni nebo neznámé DNA. ■ Pro minimalizaci falešných pozitivních výsledků je doporučeno: ♦ používání autoklávovaných roztoků ♦ fyzikální separace používaných PCR-reagencií od templátové DNA a PCR-produktů ♦ příprava reagencií i vzorků do alikvotních částí ♦ používání UV-světla k odstranění exogenních nukleových kyselin na pracovní ploše ♦ používání jednorázových rukavic ♦ přidávání DNA do reakce jako poslední ♦ pečlivá volba pozitivních, negativních a vnitřních kontrol ■ Vyloučení kontaminace je důležité zejména tam, kde je potřeba použít vysokého počtu amplifikačních cyklů, aby bylo dosaženo požadovaného produktu ♦ nízkokopiových templátů DNA ♦ degradovaných vzorků. ■ V případě pochybností je nejlepším přístupem opakování experimentu s úzkostlivou pozorností k detailům a kontrolám. ■ Jako zdroj kontaminace DNA je nejčastěji uváděn: ♦ přenos kontaminující DNA z dříve amplifikovaných produktů PCR, ♦ vzájemná kontaminace zdrojových materiálů, ♦ kontaminace plazmidem z rekombinantního klonu, který obsahuje cílovou sekvenci. Jako prevence před přenosem kontaminující DNA je v reakční směsi rutinně používána náhrada dTTP za dUTP. Následným působením uracil-N-glykosylázy na reakční směs před zahájením amplifikace. i--------1 ■ i i-------r——i--------1------------7/ 3GATAGT // 3 C T A T C A // t___X—i------1------1------1------■----y A— am pi if i kovaná nukleová kyselina PCR I + dATP, dGTP, dCTP, dUTP > ■ i ' i ľ —i------1 i C G t y m S a produkt PCR G C U A U C A K Y ' I-----J-----1-----1 < . hybridizace, kíonování_______ 1___________ následující PCR nebo sekvencování uracil-N-glykosyláza -i---------r- i---------1"" i ■■ i i c G A A z. . odštěpení uracilových zbytků -j____X—i-------1-------1-------1-------1—<— denaturace (95 °C) -*■--------r—i------- |------1-------T------ )--------- CGA AG rozštěpení řetězců G C A C A _i------1----- |-----A----- |------1------' 4 ^ťC nedochází k amplifikaci 28 ■ Alternativně lze amplifikacní produkty PCR inaktivovat fotochemicky pomocí derivátů psoralenu nebo isopsoralenu, ■ Furokumarinové sloučeniny interkalující se mezi páry bází DNA. ■ Pokud jsou tyto látky excitovány UV-světlem o vlnové délce 320-400 nm, kovalentně se vážou na nukleové kyseliny a tvoří cyklobutanové adukty s pyrimidinovými bázemi, které blokují reakci s DNA-polymerázou ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká produkt Nevyvážená reakce ■ Kontrola koncentrace jednotlivých složek Teplotní podmínky ■ Kontrola nastavení cyklů Nízká koncentrace ■ Zvýšit koncentraci templátové DNA templátu Koncentrace primem ■ Optimalizovat koncentraci primem nebo jeho sekvence ■ Navrhnout primer s novou sekvencí Různé faktory ■ Testovat reakci s pozitivní kontrolou a funkčními primery ■ Začít s novými roztoky, H20 a enzymem Nízká kvalita templátu ■ Použít primery, které amplifikují kratší (degradovaný, úseky kontaminovaný, ■ Přidat pomocné látky (DMSO) obsahující inhibitiry) ■ Optimalizovat koncentraci Mg2+ ■ Připravit nový templát ■ Zamezit častému zmrazovaní a rozmrazování templátu 3, ŘEŠENÍ PROBLÉMŮ PŘI STANDARDNÍ PCR Problém Možná příčina Doporučení Nevzniká Nízká účinnost ■ Používat pozitivní kontrolu produkt polymerázy ■ Zvýšit počet cyklů ■ Zvýšit koncentraci enzymu ■ Použít jinou polymerázu Produkt není Vzniká sekundární ■ Kontrola koncentrace složek reakce čistý amplifikační ■ Optimalizovat koncentraci Mg2+ produkt ■ Optimalizovat koncentraci primem ■ Snížit počet cyklů ■ Snížit koncentraci templátu Vznikají Nespecifická vazba ■ Použít vyšší teplotu Ta četné nespecifické produkty primeru ■ Optimalizovat koncentraci primem ■ Použít „hot start" ■ Narhnout nové primery 31 VYUŽITÍ METODY PCR 1. Základní výzkum ♦ izolace genů nebo jejich částí ♦ sekvencování DNA ♦ mutageneza in vitro ♦ modifkace konců DNA ♦ analýza (selekce) klonů z genových knihoven ♦ příprava značených sond 2. Aplikovaný genetický výzkum ♦ prenatální diagnostika (dědičných chorob) ♦ detekce mutací v genech ♦ studium polymorfizmu genů (např. RAPD) ♦ populační genetika 3. Využití v klinických disciplinách ♦ detekce patogenních mikroorganismů (baktérií, virů, prvoků, hub) ♦ identifikace onkogenů ♦ typizace nádorů ♦ stanovení pohlaví 4. Využití v praxi ♦ archeologie ♦ soudnictví ♦ kriminalistika PCR amplifikace se používa k detekci bakteriálních a virových infekcí ■ Konvenční diagnostické metody jsou založeny na schopnosti vypěstovat organismy v kultuře nebo detekovat jejich přítomnost v pacientu za použití protilátek. ♦ vyžaduje několik týdnů (mykobakterie) ♦ někdy metoda málo citlivá (protilátky) ■ Zvláštní význam má PCR při diagnostice virů, např. HIV. ♦ Cílem je detegovat infikované buňky na pozadí mnohonásobně početnějších neinfikovaných buněk. ♦ Detekce odhalí HIV inkorporovane v buňkách. Přítomnost virové RNA naznačuje aktivní infekci, a to lze prokázat provedením PCR za použití cDNA jako templátů vytvořených pomocí RT z RNA infikovaných buněk. ■ U tuberkulózy je pomocí PCR prokazován některý z vysoce konzervativních genů (sekvencí) mykobakterií pomocí primem připravených k těmto sekvencím. Amplifikovaný fragment je pak hybridizován se sondami vysoce specifickými pro daný kmen (druh). Tímto postupem je možno detekovat i jen 10 bacilů v 106 eukaryotických buněk. PCR je používána k monitorování terapie rakoviny 18q21 Nepřipojuje se k tomuto chromozomu t(14;18) 14q32 Nepřipojuje se k tomuto chromozomu Některé formy rakoviny vznikají jako výsledek chromozómových translokací týkajících se známých genů. Např. existuje translokace mezi chromozomy 14 a 18 u folikulárního lymfomu. Techniky PCR jsou schopny detekovat jedinou buňku z 106 normálních buněk, tedy daleko citlivěji než hybridizační metody. Dva PCR primery se vyberou ze sekvencí sousedících s místy zlomu na každém chromozomu. Pak pouze v buňkách, kde proběhla translokace, dojde k amplifikaci a vznikne fragment konstatní délky. Podobná strategie byla použita k detekci leukémií za použití mRNAjako výchozího materiálu. To má výhodu v tom, že mRNA představuje již amplifikační produkt daného genu genomové DNA. Jeden PCR produkt variabilní velikosti'v každém cyklu PCR fragmenty s definovanou velikosti a exponenciálně se zvyšujícím počtem v každém cyklu Jeden PCR produkt variabilní velikostí v každém cyklu 34 PCR je používána ke stanovení pohlaví u prenatálních buněk Širokou oblastí využití PCR je prenatální diagnostika obecně. Pro choroby děděné na X-chromozomum které postihují pouze samce, je stanovení pohlaví prvním krokem. To je možné proto, že samci nesou pouze jeden X a jeden Y chromozom, obsahující jedinečné sekvence. Při oplození in vitro se odebere jedna buňka z rané zygoty pomocí mikromanipulátoru, vyizoluje se DNA a ta se popdorbí amplifikaci pomocí specifických primem. Prokáže se amplifikační fragment. Výsledku se pak využívá v genetickém poradenství při výběru samicích embryí pro implantaci. o°o© Odebráni oocytů po ovulaci Oplodnění in vitro OOO ooo Kultivace do 6,-10. buněčného dělení Odebrání 1 buňky z embrya u u u y u t 1 2 3 4 5 6 Amplifikace Y-specifické sekvence ď 1 2 3 ' 4 5 6 B Samčí specifický fragment 35 Elektroforéza PCR produktu Analýza genové vazby s využitím jednotlivých spermií a) Polohy lokusu genu pro paratyroidní hormon (PTH) a lokusu Gg-globinového genu (HBG2) se nacházejí na krátkém rameni lidského chromozomu 11. b) Jednotlivé spermie se přenesou do zkumavek, amplifikace obou lokusu proběhne současně za použití dvou sad primem c) Reakční produkty se nanesou na nitrocelulózový filtr a jsou testovány próbami specifickými pro každou ze čtyř možných alel, A a a pro PTH a B a b pro HBG2. Výsledek hybridizace je vizualizována autoradiograficky. d) Z autoradiogramu lze odečíst haplotypy každé ze spermií, z nich pak vypočítat frekvenci rekombinace mezi oběma lokusy a stanovit genetickou vzdálenost mezi nimi. HBG2 PTH \ Dan D Chromosome 11 (b] w \ FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter) \ h O il (c) A PTH ■ 1 2 3 4 5 • • • ■■■■■ B • • b (d) ** ■■■ Sperm number 1 2 3 4 5 Haplotype Ab Aß aß Ab ab Take single sperm PCR amplify both PTH and HBG2 polymorphic sequences Spot products of PCRs on nitrocellulose and test with allele-specific probes Derive the haplotype of each sperm and calculate linkage between PTH and HBG2 36 Kvantitativní PCR (qPCR) Polymerazova řetězová reakce sledovaná v reálném čase (realtime PCR, online PCR, kinetic PCR, quantitative PCR, zkr. Q-PCR). Varianta PCR umožňující přímou kvantifikaci PCR-produktu v reálném čase provádí se prostřednictvím detekce a kvantifikace fluorescenčního signálu ve speciálním přístrojovém zařízení, které umožňuje ♦ cyklické střídání teplot ♦ detekci fluorescence ♦ monitorování postupu PCR v reálném čase bez nutnosti detekovat PCR-produkty elektroforeticky ijpifljry willi lupcncí iur'ji*-1a-^a"u,Tr i.i! c Air hNMflg ind cooling, ramping Hmingcöd icewiír moan to pos irion Hmpt*i nvaptm •■!■■:■■ IMiUffHPce-ff« L£D i i;m sourer CutmiscJ wlih <*f)at i[y Htm Sneppef mwor ■Hugnrnttrí SSB -n r^rr- Ptigtehn/bri(h Fl Metody kvantitativní detekce produktu Pro kvantitativní detekci produktu v průběhu qPCR existují následující metody: ♦ Na DNA se vázající interkalační barviva ♦ SYBR green I ♦ Na menší žlábek dsDNA se vázající barviva ♦ BEBO ♦ Technologie využívající fluorescenční výměny ♦ dvakrát fluorescenčně značené sondy vázající se na střední část amplifikovaného produktu • TaqMan • Molekulární majáky • QZyme ♦ jedenkrát fluorescenčně značené sondy nebo primery • FRET • LUX • PNA ♦ dvakrát fluorescenčně značené primery • AmpliFluor • Scorpions 38 Na DNA se vázající interkalační barviva 4 • 1111111111111111111 iN 111111111111111111 ľ 4 Primer Denature ...................................................... A______Á • l I I I I Al I I I lAl MIM lAl , Primer dimers ♦ A * 11111 Ai 1111 iAi 111 h iAi ▼ ,J-U lyi 111111^11111................................: - Anneal If.......♦ 11^.....4......é III- Extend •mi'».....»híí».....fmrrn» PCR product Pro kvantifikaci amplikonů se běžné používají fluorescenční kyaninová barviva SYBR® Green, která fluoreskují po vazbě na dsDNA. Fluorescence SYBR green I je po vazbě na DNA až 1000x vyšší Fluorescenční signál se zvyšuje se vzrůstajícím množstvím PCR-produktu. Signál se měří na konci elongace nebo kontinuálně. Na DNA se vázající barviva nemohou být použita u mnohonásobných reakcí Hlavním omezením je nemožnost odlišení nespecifických produktů. Nespecifické signály tvořené dimery primem mohou být zhášeny při použití primem značených specifickými fluorofory. 39 Fluorescenční výměny při qPCR ■ Pro značení primem a hybridizačních sond se používají specifické molekuly fluoroforů ♦ emitují světlo určité vlnové délky po předchozí absorpci světla odlišné vlnové délky ♦ emitovaná vlnová délka světla je vždy vyšší než absorbovaná ■ Dvojitě fluorescenčně značené sondy obsahují kromě fluoroforů také zhášeč ♦ molekula, která přijímá energii z fluoroforů ve formě světla a způsobuje její rozptýlení ♦ ve formě světla s vyšší vlnovou délkou ♦ ve formě tepla ♦ k dosažení optimálního zhášení je třeba, aby se absorbční spektrum zhášeče překrývalo s emisním spektrem fluoroforů. ■ V současné době existuje mnoho fluroforu určených pro jednobarevné nebo vícebarevné mnohonásobné detekce polymorfních sekvencí 40 Absorpční a emisní spektra fluoroforů 700 nrn i50 nrn ŮOOnm 550 nm 500 nm ThuiRkIOÍ C^ TET iF^1, ROX CrůganGraai 400 nm Cy5.5 l 70Onm ■550 nm ToKisínd-í uragan Grain ROX TAf^A HEX FliniazDoln Mi L Ů00 nm I 550 nm 500 nm 450 nm 400 nm 41 Jedna z nejcastěji používaných dvojic fluoroforu při metodách FRET ♦ donorový fluorofor FAM (6-karboxyfluorescein) ♦ akceptorový fluorofor TAMRA (5-karboxytetrametylrhodamin). FAM-dT TAMRA-dT 42 Ta q M a n technologie Hybridizační metoda, kterou využívá kvantitativní PCR např. pro detekci bodových mutací Oligonukleotid s fluorescenční značkou a zhášečem se váže na vnitřní část amplifi-kované sekvence Pokud primer vytváří homoduplex (a), je rozložen 5£-exonukleázovou aktivitou DNA-polymerázy a vznikne fluorescence Híí ^Aj >jijijjjjjjT>ittth-jt'< Extenze prostřednictvím PCR Polymeráza TaqMan.exe 43 69 Molekulární „majáky" (Beacons ™) ■ Oligonukleotidové sondy detekující přítomnost nukleové kyseliny v homogenním roztoku ■ Obsahují vnitřně zhášený fluorofor, jehož fluorescence je obnovena po vazbě na cílovou sekvenci ■ Vytvářejí sekundární strukturu vlásenky se smyčkou ♦ Smyčka má komplementární sekvenci k cílové molekule ♦ Krátká stopka je tvořená obrácenou repeticí ♦ Stopka není homologická s cílovou molekulou ♦ Udržuje v těsné blízkosti na koncích připojený fluorofor a zhášeč ♦ Hybridní forma s templátem je stabilnější něž volná forma44 Použiti ♦ Jeden z nejcitlivějších chemizmu pro detekci SNP ♦ Monitorování kvantitativní PCR ♦ Detekce mRNA v živých buňkách Výhody ♦ Vysoká specificita k cílové sekvenci ♦ Může být levný při screeningu jednoho cílového místa ♦ Možnost volby fluoroforu (i multiplex) Nevýhody ♦ Obtížný design ♦ Specifické pouze k jedinému cílovému místu ♦ Drahé při testování jednoho cíle v malém počtu experimentů Aplikace ♦ Detekce jednonukleotidových mutací v genech ♦ Detekce transgenních organizmů ♦ Detekce virů (HIV aj.) Molekulární majáky Excitace iiiiiiiiiiii n nu n n n n II Mil II I I lllllllllllllll ■46 Príklad detekce SNP s vice variantami sondy ♦systém vyžaduje duplikáty sond ♦Jednobarevné ♦Vícebarevné Zhášeč olekulární aják Homozygot ._. . , standardní typ Heteroyzgot Homoyzgot mutant V JA í i ■ MoBe.exe 1.0 r o C.& ' § aa CO Si t>.4 O ít «r 90 ■"i /: «4 .V " /* 10 20 30 ■;- tO 30 30 40 10 Počet cyklů v termocykleru 2U 3ú 4fl 48 BD QZyme™ Substrate BD QZyme™ Gene-Specifk Primers BD QTaq™ DNA Polymerase U Hl — R2 3" PN-ier U Technologie BD QZyme (ram) Hl Inocthn ■ H2 dNTPs, buffer, Mg2+ DNA Polymerase ■ I 5" Pnmer Antlsense strand of the DNAzyme Substrate Recognition (R) and Čata lytic (O domains 3' II111 5' — First-Strand cDNA Ctangetf ftp 5" primer 3' --------------- Mix and begin thermal cycling 5" Primer primes synthesis of antlsense strand containing Inactive DNAiyme 111II 5' HI 5' 3'*------ active rurtľr-í - 1 J L I 3- 3'Primer primes synthesis of sense strand containing active DMAzyme 3" Primer Hi FAM I Cleavage© ^ DNAzyme sense st ra nd blncfc substrate ů catalyzes cleavage (fam 49 Technologie sond s přenosem energie fluorescenční rezonancí (FRET, Fluorescent Resonance Energy Transfer) FRET je excitovaný stav interakce dvou fluoroforů závislý na vzdálenosti, ve kterém je emise energie z jednoho fluoroforů (donoru) na 3'-konci první sondy spojená s excitací druhého (akceptoru) na 5'konci druhé sondy Přenos energie mezi ligandy se může uskutečnit na vzdálenost 10-100 A (1 -5 nukleotidů) Citlivost FRET (změny intenzity fluorescence) může detekovat změny vzdáleností 1-2 A FRET sondy Excitace 470 nm Emise 640 nm 51 03 AmpNFluor™ Systém (univerzální primery) AmpNFluor je univerzální detekční systém umožňující amplifikaci a detekci v jedné reakční směsi Metoda je založená na inkorporaci fluorecenčně značeného primem s vlásenkovou smyčkou Primer je navržen tak, že fluorescenční signál je tvořen pouze tehdy, když je porušena sekundární struktura primem během jeho inkorporace do PCR produktu Nezačleněné primery vykazují extrémně nízkou fluorescenci ♦ Není potřeba purifikovat produkt pro kvantifikaci ♦ Ampli fluor primery jsou univerzální, pracují spolu s jinými PCR primery Využití ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ ♦ Q-PCR - vysoká přesnost In situ PCR Detekce SNP Excitace Studium exprese (RT-PCR) fluoroforu Multiplex reakce 4$5 nm Komerční kity T** ♦ rRNA, bax, bcl-2, fas (apoptóza), HPV-16, p AM PSA, ß-aktin, interferony, interleukiny Přenos energie z FAM zhášená DAB < 100Á Univerzální cílový primer 52 AmpliFluor 1. 1-2 cykly PCR amplifikace s primerem 1 a alelově specifickým primerem 2 s přídatnou sekvencí (Z) na 5'-konci 2. 30 cyklů s univerzálním AmpliFluor primerem, který je komplementární k sekvenci Zas primerem 1 3. Během amplifikace druhý řetězec vytlačí strukturu AmpliFluor primem a dojde k separaci fluoroforu a zhášeče, což umožní emisi fluorescence Hetero2ygotní vzorek DNA Alela 1 Alela 2 Primer 2 AmpliFluor UniPrimer 1 SNP ' 'T I ■ \ • m Primer 2 , -T\ Z -v AmpliFluor UniPrimer2 • Primer 1 Primer 1 Primer 1 .■iiiiiiiiiiiiiiiiifliiiiimiiM AmpliFluor sondy IUI Excitace 495 nm Technologie „si ■ Škorpióny jsou bi-funkční molekuly obsahující PCR primer kovalentně vázaný k hybridizační sondě ■ Molekula obsahuje na 5'-konci fluorofor, který inte rag uje se zhášečem redukujícím fluorescenci ■ Po proběhnutí PCR dojde k intramolekulárnímu přeskupení a fluorofor a zhášečjsou separovány, což vede ke vzniku světelného signálu ve zkumavce >rpiónů" (Scorpions™) Zhášeč na druhém oligonukleotidu Zábrana \ / PCR primer Reportérovy fluorofor Sekvence sondy Krok 1: Primer ěkorpiónu je prodloužen na matricové DNA *---------# »----------------............ Krok 2: Prodloužený primer je denaturovan a zhášeč diasociován Krok 3: Po snížení teploty se prodloužený škorpión přeskupí a v cílovém miste se vytvoří fluorescence *______. *----------•—** Scorpions.exe Scorpions™ Bi-probe í' feptťter to ,J Quentfiliíg BlKkŕr or The lluoresiarice. Tar^nOMA Cwnpíerriflntary Sequence! McsxymhiüiBsd DNA Strane Ltůp Sequence ±9 Errvssw af íha fluore«emu. Scorpions™ Uní-probe TsfifltDlM PCRřrimer Seqtierrai DřJA S^ .J QuerihtigofrKs nuor«círire. -S E.T -Í.S.IÍ-.-, of [he nuorascenoá: 56 Využití „škorpiónu" ■ Škorpióny jsou vylepšením TaqMan a molekulárních majáků ♦ Kombinují sondu a primer v jedné sekvenci ♦ Vysoce specifické ♦ Zhášená sonda vykazuje nízké pozadí ♦ Sonda vidí prodloužení produktu jejího vlastního primem - konformační přeskupení uvnitř jedné molekuly ♦ Design sekvence je snazší než u molekulárních majáků ♦ Využití při Q-PCR, genotypizaci a haplotypizaci Technologie LUX™ ■ LUX využívá dva primery, znichž pouze jeden je značený ■ Zhášení primem je zajištěno sekundární strukturou (vlásenkou) a přítomností páru dG-dC nebo dC-dG na 3'-konci ■ Primery se snadno navrhují ■ 3'-konec značeného primem detekuje SNP ■ Možnost využít různé fluorescenční značky Light Upon extension) I - Přímý primer {značený u 3'-konce) 3'----------------------------------------- 5 5'----------------------------------------- 3' Reverzní primer (neznačený) C _ Fluorescent R DO po prodlouženi primem 3 ----------------------------------------- 5 5'----------------------------------------- 3 Sondy Light-up Slouží pro specifickou detekci sekvencí nukleových kyselin v homogenním roztoku. Jsou připraveny z ♦ Analogu nukleových kyselin - PNA (Peptide Nucleic Acid) ♦ Asymetrického kyaninového barviva, které po vazbě na DNA 50x intenzivněji fluoreskuje Fluorescence je pozorovatelná za optimálních podmínek pouhým okem Peptidová nukleová kyselina (PNA) je analog nukleových kyselin, ve kterém je nahrazená cukr-fosfátová kostra pseudopeptidovým řetězcem. PNA se váže komplementárně k DNA a RNA Watson-Crickovým párováním bází a tvoří vysoce stabilní duplexy. Interakce PNA:DNAje více selektivní než DNA:DNA nebo RNA:RNA a může ji destabilizovat pouhý jeden chybný pár bází už při 20°C, z toho důvodu je vhodná pro detekci SNP hybridizací. lM»Jrt.lJILlk.III.LII.I>ll...M liJfcLllaMI*lia**JlMillLL*ÍldJkLII.Ji ■«■■■■■■■ Light-up.exe ii nHBIII MéJLMJLméMJJBIAii^IIIeIiJLIJB^JJUL^IMJÍ IJLJLHéIméIBéIJHIéL^IIIéLI 59 NH N / Báze O O A NH N / Báze O O A NH N / Báze O O A NH Invazivní bis-PNA sondy tvořící triplex s DNA Č v V TT^ kf bis-PNA dsDNA první inter mediát vzniklý Hoogsteenovým párováním P-smyčka N / Báze O O <\ NH PNA - peptidova nukleová kyselina 60 Modifikace PCR používané při analýze genomu 61 Amplifikace sekvencí klonovaných ve vektorech Primer [w Transformované bakterie s rekombinantním vektorem Izolace DNA z jednotlivých kolonií n—i i—i i—i PCR je použitá pro amplifikaci klonované DNA s využitím primerů pro vektorové sekvence Analýza PCR produktů na gelu Metoda je vhodná pro skríning knihoven 62 Modifikace koncu DNA, expression cassete PCR (EC-PCR) Připojení sekvencí prostřednictvím 5'-konců primem Cílová sekvence J ^ c J I Denaturace j a připojení I ° příměrů 1 a 2 I T /^ I 3 0rTAAGCCGG 51 Primer 2 .sticky foot" Primer 1 5- GCGCMGc^ m EcoR\ G^ATTCGGCC CTTA/j|gCCGG H/ndlll j PCR Target region Přidávané sekvence ♦ RE místa ♦ Promotory 5" gcgcaWgctt ♦ Terminátory 3" CGCGTTCg|aA ♦ Translační signály Asymetrická PCR Podobně jako jiné DNA, lze produkty PCR sekvencovat. Templátem pro Sangerovu metodu jsou ssDNA. Pro jejich přípravu se používá se technika označovaná jako asymetrická PCR, při níž jsou tvořeny preferenčně ssDNA. Standardní PCR se založí s tím rozdílem, že výchozí koncentrace primem se liší faktorem 100 (tj. jeden z primem je ve 100 x vyšší konectraci než druhý). Dvouřetězcové DNA fragemnty se tvoří až do doby, než se jeden z primem nevyčerpá. Druhý primer pak dále syntetizuje pouze jeden z řetězců - i když se tento tvoří spíše lineární než exponenciální rychlostí, je jeho množství postačující pro sekvencování. Primer není k dispozici / Cycseqpc.exe PCR fragment dvouřetězcové DNA Denaturace a připojení primerů ^ Dostupný primer Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů Syntéza nového řetězce Denaturace a připojení primerů atd. ot Obracena PCR (l-PCR) PCR umožňující amplifikovat úseky DNA o neznámé sekvenci ohraničené na obou stranách DNA se známou sekvencí. oblasti s neznámou sekvencí známa sekvence štěpení restriktázou ve specifických místech * l cirkularizace a ligace mnoho kružnicových molekul Primer 1 o _o pnmery se připojuji ke známé sekvenci a směřují směrem ven * AAA/i|A/\^J^ analýza sekvence příprava sond pro mapování chromozomu nebo primem pro PCR 65 Využití adaptorů pro PCR amplifikaci neznámé sekvence známá sekvence GATC reštrikční štěpení i Y uCTAG GATC "—"■•"«■■»'■■»-" -»• =Cv. /y.rfn-iT-ľffi C TAG a Tra^rr.n^;^ CTAG GATC '--'-'■-?"*-•-■■*■■>■'■'■-"■•'*'-■'......'■ ■ i 'tiraiHTjwrpíw-.-* i------ 1................1 1 Q ligace GATC GATC 3 CTAG t: t amplifikovaný úsek neznámé sekvence ^ 3 "Bubble linker" r GA1 C i-.. —__ - - fO^ . ^^ -• M-Y »■» i ctagí----------=ľ=:c^r ^y- ■ =3 ^°^V, iw,-..«if.r»r.ii 2' G Al O r/vr.: ■•-,__^ii^ ^raí^w -'"» •* —»*-— 66 Zpětná (reverzní) PCR (RT-PCR) detekce sekvencí na RNA RNA nemůže sloužit jako templát pro PCR. Produkty RT-PCR se tvoří, jestliže je izolovaná RNA nejdříve převedena na cDNA pomocí retrovirové zpětné transkriptázy ♦ M-MuLV = Moloney murine leukemia virus ♦ AMV = avian myeloblastosis virus a poté amplifikována pomocí PCR se dvěma specifickými primery. Nevýhody: Zpětná transkriptáza je termolabilní a obvykle nefunkční nad 42°C. Navíc v některých případech znemožňuje převod RNA na cDNA, zejména při složité sekundární struktuře RNA. Současná technika: ♦ Termostabilní Tth DNA polymeráza z Thermus thermophilus\e schopná převést RNA na DNA (RNA dependentní DNA polymerázová aktivita) za přítomnosti Mn2+ iontů při 72°C. ♦ Pomocí stejného enzymu je poté prováděna PCR reakce. Použití: ♦ mRNA ♦ virové genomy (např. hepatitis C virus, virus chřipky, pikornaviry) 67 Princip RT-PCR i---------í 3 AAA Reverse transcription: M~MuLV or AMV Reverse Tran-scriptase orTth DNA Polymerase. I---------1 PCR I 1 I I : AAA Z3 RNA Primer: Oligo CdT)12_20 or hexamers or site specific primer cDNA Primer: site specific primers Amplified DNA 1 1 1 1 1 ' - '■ ■■■ -■ j i 1 [ ! I - 1 1 1 1 1 I 1 1 ' " ' II 1 1 1 68 Návrh primem pro RT-PCR RT-PCR amplifikace mRNA vyžaduje dvojici specifických primem. Primery můžeme navrhnout tak, abychom odlišili produkty vznikací při RT-PCR a při standardní PCR s genomovou DNA. Dva přístupy pro návrh primem: PCR product Intron 1 Primery, které se připojují k sekvenci 2 exonů na obou stranách určitého intronu. Amplifikační produkt z genomové DNA je větší než produkt RT-PCR. Primery komplementární k sekvenci na spojení exon/exon. Takové primery neamplifikují genomovou DNA. 1 __^ ^ Genomic DNA Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 1 mRNA Exon 1 Exon 2 " ~*" "^~ RT-PCR product PCR product upstream pnmer no PCR product downstream primer Genomic DNA 1 Exon 1 Intron 1 Exon 2 Intron 2 Exon 3 mRNA I Exon 1 Exon 2 - —...... Exon 3 RT-PCR product 69 Uspořádaní R ■ Jednokrokova RT-PCR ♦ Tth DNA polymeráza ♦ dvojice primerů ♦ syntéza cDNA za přítomnosti Mn2+ ■ Výhody: ♦ rychlost ♦ není riziko kontaminace ♦ vyšší citlivost (probíhá při vyšší teplotě) r-PCR reakce ■ Dvoukrokova RT-PCR ♦ První krok: zpětná transkriptáza + oligo(dT) ♦ Druhý krok: Taq DNA polymeráza + dvojice primerů ■ Výhody: ♦ umožňuje optimalizovat zvlášť zpětnou transkripci a zvlášť PCR ♦ umožňuje syntézu dlouhých produktů (až 14 kb) 70 DD-PCR, Differential Display-PCR V genomech obratlovců existuje cca 100 000 strukturních genů V jednotlivých tkáních je exprimováno pouze malé procento z nich DD-PCR slouží pro studium úrovně exprese genů ♦ v různých tkáních ♦ při patologických procesech Princip: ♦ Vzorek RNA je převeden na cDNA pomocí RT-PCR ♦ s oligo-dT primerem, který má na 3'-konci dvě degenerované báze: 5' TTTTTTTTTTTTMN 3' , kde M = A, G nebo C; N = jakýkoli dNTP) ♦ druhý primer je směsný náhodný 8-10mer tvořený náhodnými sekvencemi ♦ Pro odhalení co největšího počtu mRNA mohou být využity různé sady druhého náhodného primem ♦ RT-PCR se provádí s radioaktivně značenými oligonukleotidy ♦ Rozdílně exprimované mRNAjsou detekovány na autoradiogramu 71 Nur77 «... 7B7.C 1*1.7 «.7 13 1 fl.t SSS^rt 1ÄS.4 H-B 4.B 1 rt.R 1 1* 1:M 1:12» n.n n-.itdh RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) ■ Rychlá amplifikace konců cDNA (RACE) je technika založená na PCR vyvinutá k usnadnění klonování cDNA o úplné délce s 5'a 3'konci poté, co byla stanovena část sekvence cDNA jinými metodami. ■ Syntéza cDNA z mRNA o úplné délce není pomocí reverzní transkripce snadná. ■ Pomocí RACE se amplifikuje kratší úsek od jednoho konce (3' nebo 5') a ze střední části o známé sekvenci. ♦ 3'RACE ♦ 5'RACE 72 3 RA( Využívá výhody přirozeného poly(A) konce na mRNAjako místa pro zahájení PCR amplifikace. Při reverzní transkripci od 3'konce je první řetězec cDNA je inciován u poly(A) pomocí oligo-dT hybridního kotvícího primem. ♦ 17 oligo-dT zbytků navázaných na 17-mer adaptor ♦ má Trn vyšší než samotný oligo(dT17) ♦ je vhodné, když nese reštrikční místa pro následné klonování Amplifikace je docílena bez další purifikace, za využití PCR kotvícího primem a uživatelem navrženého specifického primem ve vnitřní části mRNA, která je cílem další analýzy. mRNA WWWWVWWWWWWWWWAAAAAAAAAA cDNA* A**- (-) strand I I I ) : PCR Denature Anneal primer |3" amp Extend > f |3' amp (+) strand (-) strand mr— Denature Anneal primer Extend 3' amp| (+) strand TR (-) strand |-»"] Denature Anneal primers: 3'amp|and r"H Extend Up to -106 I3'amp| copies of cDNA (+) strand TR (-) strand E 73 5RA( ■ První řetězec cDNA je nasyntetiozován z celkové poly(A) RNA za použití prvního genově-specifického primem (SPI)pomocíAMVRTa deoxynukleotidového mixu. ♦ První řetězec cDNA je purifikován od neinkorporovaných nukleotidů a primem SP1 ■ Reakční produkt první reakce (cDNA) je pak prodloužen pomocí terminálni transferázy, která přidá homopolymerní konec dA na 3'konec cDNA ■ cDNA s napojeným koncem je pak amplifikována PCR s použitím druhého genově-specifického primem SP2, oligo dT-kotvícího primem a Taq polymerázy - stejným systémem jako u 3' RACE. ■ Pokud je to třeba, získaná cDNA může být dále amplifikována s použitím druhé PCR s využitím nested (sousedního) primem SP3 a PCR kotvícího primem. mRNA WWWWWWWWWWWWWVWAAAAAAAAAA ~(-) strand |5ŘŤ] cDNA" Remove excess 5RT primer Tail cDNAs with dATP V AAAAAAAAAA PCR ^ {-) strand Í5ŘŤI Denature Anneal primer >•■•■ mm Extend (+) strand >n AAAAAAAAAA (-) strand 5RT Denature ______ Anneal primerfšjjämg] Extend l — llll TR(+) strand -. ■<- TR(-) strand |5' amp| Denature Anneal primer [•"•] Extend If TR(t-) strand —>■ TR(-) strand |5' amp Denature Anneal primers: h"-|and[5' amp Extend TR(+) strand Upto-106 TR(-) strand Is7^^ copies ofcDNA 74 Degenerovaná PCR Využívá pro amplifikaci směsi degenerovaných primem Používá se, jestliže nevíme, která z variant sekvence se může v g enom u vyskytovat ♦ Kolísavé sekvence ♦ Sekvence předpokládané _ ^^^_ na Základě zpětné Trp Asp Thr Ala Gly Gin Glu translace z proteinového 5f tgg gay acn gcn ggn car ga 3f motivu T G G G G ♦ Degenerace je zajištěna c a a a a při syntéze primem. Není t t t nutné objednávat zvlášť c c c Všechny varianty Výsledkem je 256 variant primeru Příklady využití: ♦ Vyhledání sekvence DNA na základě sekvence aa stanovené u proteinu ♦ Vyhledání a klonování homologických genů např. člověka a myši ♦ Hledání a studium genových rodin s určitou strukturní podobností ♦ Fylogenetické a evoluční studie: hledání a srovnávání ortologních genů 75 Overlap extension PCR má využití v mutagenezi 3'<- 4 5'- Primer B 4 V<- 3'-f.- 5'- PrimerA Primer A' 5" 5' >3' i *>3' 3'-* ■5' 4 Primer C ■5' ->3' 4 4 smíchání a denaturace 4_ _ 5' ■5' ■3' 3' 3' přesah DNA polymeráza dosyntetizuje 5' chybějící řetězce •3' 4 PCR s primery B a C 76 Modifikace PCR používané v diagnostice ■ PCR metody nabízejí následující výhody: ♦ rychlost ♦ je potřeba malé množství buněk 77 PCR-RFLP ■ Amplifikace známé sekvence se dvěma specifickými primery ♦ Cílová sekvence (obvykle určitého genu) o délce 1 až 2 kb je amplifokována při vysoce stringentních podmínkách. ♦ Výsledkem amplifikace jsou amiikony (PCR produkty o stejné délce) detekované elektroforeticky ■ Amplikony jsou štěpeny reštrikční endonukleázou se 4 bp rozpoznávacím místem a poté opět analyzovány pomocí elektroforézy ■ Separace fragmentů DNA v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu. ■ Srovnání restrikcních fragmentů amplifikované DNA u různých vzorků. PCR-RFLP fingerprinting ilustrovaný na příkladu genu pro 16S rRNA (rDNA-RFLP) Chromozóm A Chromozóm B 1500 bp 0 .50 200, , 900 .350 0 Amplifikace Restrikce Elektroforéza A B ± 1500 bp {S7 200, 1250 1250 900 350 200 50 <: ^ : Univerzální primery komplementární k vysoce konzervativním oblastem na koncích genu pro 16S rRNA Pozn.: V závislosti na volbě primem může být provedena PCR-RFLP analýza jakéhokoli genu 79 Prenatální diagnóza hemofílie pomocí PCR-RFLP V analyzované oblasti DNA mohou být až tři místa fíc/l, přičemž jedno z těchto míst v intronu 18 je polymorfní. Fragment DNA o délce 142 bp obklopující polymorfní místo fíc/l je nasyntetizován s pomocí oligonukleotidových primem. Normální alela má fíc/l místo a proto je fragment štěpen na 99 + 43 bp fragmenty Polymorfní místo může ♦ chybět na obou chromozomech (5), ♦ přítomné na jednom a chybět u druhého (2,4,7) ♦ nebo být přítomné na obou (1,3,6). ' »im m * ttáŕ/ha. s Áesttefi'/ú iD <•* IčoMťô/y (TÍ D O 1 f tf-ec tmákA 1 I Bui-*»*** f BŕftctnrtO 1——■ heíerczxjqc r J -----honíc vyčte t x/r syn *f" Mnohonásobná PCR (multiplex PCR) ■ Při multiplex PCR je použito více párů specifických primem. ■ Dochází k amplifikaci více cílových sekvencí při jedné reakci. ■ Použití a výhody: ♦ Vyhledávání změn na dlouhých úsecích DNA ♦ Testování vzájemně nesouvisejících oblastí na DNA ♦ Amplifikace vnitřních kontrol současně se vzorky ♦ Nižší cenové náklady než při samostatných amplifikacích ■ Používané aplikace: ♦ Detekce specifických toxinů produkovaných některými organizmy (Clostridium difficile, Staphylococcus aureus) - může být detekováno až 7 různých genů kódujících toxiny. ♦ Detekce více genů kódujících rezistenci k různým antibiotikům. ♦ Detekce více druhově specifických genů - identifikace organizmů ♦ Ko-amplifikace vnitřních kontrol Příklad detekce lyzogenie v genomu bakterie pro!ág serol- síupiny * -► _~ profag serol. skupiny F -> Staphylococcus aureus pr0fág serol. skupiny B -> pomocí multiplex PCR vnitřní kontrola -> Príklad použiti multi mutací v je Diagnóza Duchennovy muskulární dystrofie za použití mnohonásobné PCR k detekci deletovaných exonů ■ V genu pro dystrofin o délce 2000 kbp je navrženo celkem 9 úseků určených k amplifikaci. ■ Tyto úseky představují části genu, které bývají nejčastěji postiženy delecí. ■ Vzorky DNA z pacienta jsou amplifikovány za současného použití sady devíti primem v jedné reakci a produkty jsou separovány na elektroforéze a barveny EB. ♦ Pacient 1 má 1 deleci, pacient 2 má velkou deleci asi 1000 kbp. Ostatní mají více různých delecí. Dlex PCR pro analýzu dnom genu n «tc t e hři (bei. dt\ecť\ Odstupňovaná PCR Open transfer of 1st product to new tube -------------------------------------------------------------►- Aerosol contamination 1st amp! if i cation 15-30 cycles 1st round product [ Při PCR pomocí vnějších a vnitřních primem („nested" PCR) se amplifikace provádí ve dvou krocích. Metoda má oproti standardní PCR velmi vysokou citlivost. Používají se 2 modifikace: ♦ Dvoukroková ♦ První kolo zahrnuje 15-30 cyklů amplifikace s jedním párem vnějších primem. ♦ Potom je reakce převedena do druhé zkumavky a prováděna amplifikace zahrnující opět 15-30 cyklů s párem vnitřních primem. ♦ Jednokroková ♦ První kolo amplifikace s jedním párem primem se provádí při nestringentních podmínkách (nižší teplota pro připojení primem) s 10-15 cykly. ♦ Následuje reamplifikace zahrnující 15-30 cyklů při stringentních podmínkách s vnitřními primery, při které se ověří specifita amplifikace z prvního kola. i 2nd amplification 15-30 cycles t 2nd round product No product transfer ----X— 1st amplification Low annealing temp cGCGCfi wy/////////////A GCGCGC CGCGCG 2nd amplification High annealing temp GCGCGC\ Predominant 2nd round product wßmv////////Mm& 1st round products 83 Alelově specifická PCR (AS-PCR) Využití ♦ Pro detekci bodových mutací v genomech ♦ detekce homozygotního a heterozygotního stavu v klinických disciplínách Je prováděna ve dvou nebo více paralelních reakcích ♦ V první reakci je horní primer komplementární ke standardní sekvenci ♦ V další reakci k mutantní nebo polymorfní sekvenci ♦ Spodní primer je v obou reakcích stejný Předpokládá se, že k elongaci dojde pouze tehdy, pokud jsou primer a cílová sekvence plně komplementární. Uvažujeme-li homozygotní stav, k amplifikaci bude docházet pouze v jedné reakci. Metoda byla popsána nezávisle pod různými označeními a využívá dva odlišné přístupy. ♦ První přístup je založen na chybějící elongaci v důsledku chybného párování bází na 3'-konci primem. ♦ amplifikaci nedostupný mutační systém (ARMS), ♦ PCR-amplifikace specifických alel (PASA) ♦ alelově specifická amplifikace (ASA). ♦ Ve druhém přístupu se chybné párování nachází ve střední části sekvence primem a brání tak hybridizaci primem k cílovému místu v případě, že se v templátové DNA vyskytuje. ♦ kompetitivní připojení oligonukleotidu (COP). Pro snazší odlišení heterozygotního stavu v jediné reakci je používána varianta označená jako PCR-amplifikace více specifických alel (PAMSA) nebo dvojitý ARMS. ♦ Jeden z alelově-specifických primem obsahuje na 5'-konci přídatný úsek několika nekomplementárních nukleotidů, a tak mohou být amplifikační produkty obou alel rozlišeny na základě své délky. Metoda je obecně velmi citlivá na optimalizaci experimentálních podmínek reakce, zejména 84 koncentrace jednotlivých reagentů a templátové DNA._________________________________ PCR s degeneroval oligonukleotidovými primer ■ DOP (degenerate oligonucleotide primer) PCR slouží pro uniformní náhodnou amplifikaci DNA pokud je k dispozici pouze malé množství vzorku. ■ Další postupy (klonování, značení, hybridizace, následná PCR) mohou být potom provedeny účinněji. ■ DOP-PCR se používá jako první krok při: ♦ hybridizaci in situ ♦ srovnávací genomové hybridizaci (CGH) ♦ přípravě DNA fragmentů frakcionovaných podle velikosti pro další hybridizace ♦ analýzu DNA ze špatně kultivovatelných organizmů ♦ analýzu nebo klonování stopových množství DNA lými y (DOP-PCR) Amplifikace DOP-PCR vede ke vzniku různě dlouhých DNA fragmentů, které jsou viditelné na agarózovém gelu obarveném etidiumbromidem ve formě šmouhy. ■ DOP-PCR primery mají definované sekvence na 5'- a 3'-koncích a náhodnou hexamerovou sekvenci mezi těmito definovanými konci. ■ Prvních 5 cyklů DOP-PCR probíhá při velmi nízké stringenci. ■ Dalších 35 cyklů probíhá při vyšší teplotě pro připojení primem. ■ Za stringentnějších podmínek je materiál vytvořený při prvních cyklech amplifikován preferenčně, protože obsahuje kompletní primerovou sekvenci na obou koncích. Na jiných místech se DOP-primer při stringentních podmínkách neváže. DP-PCR DOP-PCR primer Template DNA DOP-PCR products Náhodně amplifikovaná DNA ■ Náhodná amplifikace využívající jeden nebo více primem s neznámou homologií k cílové sekvenci DNA ■ Vzniká více amplikonů s různou velikostí a rozdílným molárním množstvím, nevyžaduje se proto štěpení restrikčními endonukleázami ■ Úspěšná, rychlá a jednoduchá technika pro DNA fingerprinting popsaná nezávisle pod různými označeními: ♦ AP-PCR (arbitrarily primed PCR fingerprinting) ♦ RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) ♦ DAF (DNA-amplified fingerprinting) ♦ MAAP (multiple arbitrary amplicon profiling) ♦ PCR-mediated genotyping ■ Princip metody: ♦ Metoda používá obvykle jeden krátký primer (8 - 10 bp nebo M13). ♦ Teplota pro připojení primeru je mnohem nižší než teoretická hodnota Ta. ♦ Za těchto podmínek dochází k nasedání primeru s vysokou pravděpodobností na více místech na obou řetězcích chromozomální nebo plazmidové DNA. ♦ Obvykle se vyskytne několik míst pro připojení primeru umožňujících nasednutí primem 3' konci k sobě, která se vyskytují na protilehlých řetězcích, a nejsou od sebe příliš vzdálená. ♦ Výsledkem je amplifikace mnoha fragmentů s různou délkou (max. 2000 bp). «7 Náhodně amplifikovaná DNA ■ Použití: ♦ Rychlá typizace většiny izolátů mikroorganizmů ♦ Typizace genomové rostlinné DNA z různých kultivarů ♦ Taxonomické studie a identifikační postupy ♦ Analýza mikrosatelitů ♦ AP-PCR může být kombinována s DGGE nebo SSCP analýzou. ♦ Produkty AP-PCR slouží pro přípravu hybridizačních sond používaných při binární typizaci ♦ Metoda má vyšší diskriminační schopnost než PCR 16S-23S mezerníkových oblastí, ale nižší než Rep-PCR. ■ Nevýhody: ♦ Nízká re p rod u kováte I n ost mezi laboratořemi. ♦ Částečné zvýšení reprodukovatelnosti je možné provedením reakce s různým ředěním DNA. Výsledek ovlivňují plazmidy přítomné v izolované DNA. 88 Chromozóm A Chromozóm B Chromozóm C Náhodné amplifikovaná DNA (AP-PCR) 1000 200 1000 200 1000 Amplifikace při nízké stringenci (nízká teplota pro pripojení primeru) 500 {> Příklad elektroforézy s AP-PCR produkty 1 500 bp -> 300 bp -> Elektroforéza v agarózovém nebo polyakralamidovém gelu i> B 1000 A B 200 100 4/ü-repetice je velmi variabilní, ale obsahuje sekvenci, která je specifická pro člověka. Připraví se dva primery, každý pro jeden směr, přičemž se využije nejvíce konzervativních úseků těchto sekvencí. ■ Primery nelze použít společně, neboť vzájemně hybridizují. Sekvence Alu však mohou být přítomny na DNA v obou směrech, takže primery se používají samostatně. ■ Lidské sekvence se budou amplifikovat, pokud leží mezi sousedními >4/ü-repeticemi, které jsou umístěny (orientovány) v opačných směrech. Tvoří se různý počet fragmentů lidské DNA v závislosti na velikosti lidské DNA v buněčné linii. Tato technika je často používána pro "odhalení" lidské DNA od ostatních DNA. 94 Alu\-PCR Primer A 3' AACGTCACTCGGCTCTA 5' Cast Alu sekvence 5'... ttgcagtgagccgagat ... 3' jedinečná pro primáty 3f...AACGTCACTCGGCTCTA...5' Primer B 5' TTGCAGTGAGCCGAGAT 3' amplifikace s primerem A A A A/iii Alu+- ~+Alu Alu*- Alv amplifikace s primerem B 5'. .. TTGCAGTGAGCCGAGAT ... 3' 3' TAGAGCCGACTGACGTT 5' 5'...ATCTCGGCTCACTCGAA...3' 3'. .. AACGTCACTCGGCTCTA ... '5 5' TTGCAGTGAGCCGAGAT 3' B 3' ... TAGAGCCGAGTGACGTT ... 5' Analýza mezerník< (RS-PCR, PC U prokaryot obsahují rDNA operony geny pro všechny tři typy rRNA (16S, 23S a 5S). Geny pro 16S a 23S rRNA jsou odděleny mezerníkovou oblastí, která se liší délkou v závislosti na druhu (od 278 bp u mykobakterií do do 2 kb u borrelií). Navíc u většiny Eubakterií se vyskytuje více kopií rDNA operonu, u nichž se vyskytují menší rozdíly v délce mezerníku. 500 bp 100 bp^ U Staphylococcus aureus se nachází v genomu 6 rrn operonu, všech 6 mezerníku mezi 16S a 23 S rRNA se může lišit svou délkou. Dvých oblasti v rDNA R-ribotypizace) Chromozóm A Chromozóm B 23S ^ť—-J - -ř~J» I^É^z^ ^ '55^ \& tffi 150 tap 7 t * i ■ * * ( ■ í> 23S 23S , , <° 350 Amplifikace Elektroforéza A I B 350 250 150 —>—>—>—>■ Návrh pimerů (^^) komplementárních k ohraničujícím sekvencím ■<- —> —>—>—>—> ■ ■<-*■ •*■—>—£ ■ —>—>—> —> —>—>—> —>■ <—«■ —>—>—>—>—>. ■*-—>- -<—«■ ■*-—>—t ■<-*• ►—>—>—>. ■ <1— 20 000 (b) selective PCR amplification Hindill (A/AGCTT) NNNNNNNNNCIASCTTNNNN-NNNNNNNNNGTCGAlANNNN- A HOI NNNNNNNNNCAGCTT_, NNNNNNNIMNGTCGAAlflNNN NNNNNNNNNCAGCTT_ , NNNNNNNNNGTCGAA0NNN------j A NNNNNNNNNCAGCTT„ / NNNNNNNNNGTCGAA0NNN------/ Taq] (T/CGA) —If--------nnnnt[č& -ff----------NNNNAGQ NNNNNNNNNCAGCTT 3'~NNNNNNNNNGTCGAA NNNNTICGGNNNNNNNNNNN NNNNAGCJCNNNNNNNNNNN no amplification amplification ------CAGCCNNNNNNNNNNN-5' 5'-NNNNNNNNNCAGCTTA- \ /---------[GTTCGGNNNNNNNNNNN-3 ' -*---lek JAGCCNNNNNNNNNNN T02 102 In situ PCR (PCR in situ, incell PCR) Hybridizace in situ (ISH) umožňuje lokalizaci určité sekvence NK uvnitř jednotlivých buěnk, ale vykazuje nízkou detekční aktivitu. Konvenční PCR vyžaduje nutnost tkáně nebo buňky destruovat a izolovat NK, nelze asociovat výsledek amplifikaceke specifickému histologickému typu buněk. In situ PCR kombinuje vysokou citlivost PCR s cytologickou lokalizací sekvencí poskytnutou ISH ♦ PCR in situ hybridization ♦ incell PCR ♦ PCR driven ISH umožňuje asociovat výsledek amplifikace ke specifickému histologickému typu buněk umožňuje korelovat výsledek s histopatologickými rysy nebo množstvím buněk, obsahujících cílovou sekvenci Indirect In Situ PCR in situ amplification m S/fa hybridization for detection PCR-product Direct In Situ PCR in srtü amplification with incorporation of labeled niicleotiiles direct detection 5** 3'-C 1-V :-5' PCR-product SMI |-3! 3-|_ -5' s'-C labeled probe % [abeled nucleotides Specifické sekvence jsou uvnitř buňky amplifikovány, čímž se zvýší počet kopií natolik, zeje lze snadno detekovat ♦ pomocí ISH (nepřímá in situ PCR) ♦ imunochemicky (přímá in situ PCR) 103 Příprava vzorku pro in situ PCR in Situ PCR tm Glass Slkfes >:: 111! -_^^-. cytospins, tissue sections fixation permeabiiizaíion i ŕ-- r I ^3 thermal cyding sealing ofcoversllp primers, nucleotides. DMA polymerase Fixace buněk nebo tkáně -zachování morfologie (paraformaldehyd) Permeabilizace - přístup PCR reagentů k NK (detergenty, proteázy) ♦ průběh PCR ♦ v buněčných suspenzích ♦ v cytocentrifugačních preparátech ♦ pod mikroskopickým sklem Detekce intracelulárních produktů ♦ ISH ♦ Imunochemicky (protilátky proti DIG-11-dUTP, fluorescein-dUTP, 3H-CTP) In situ PCR má aplikace jak ve výzkumu, tak v diagnostice: ♦ detekce virových nebo provirových N K (HIV, CMV, HBV, HSV-2) ♦ chromozomální přeskupení, translokace, hledání jednokopiových genů ♦ mapování nízkokopiových chromozomálních sekvencí v metafázických chromozomech ♦ detekce nízkokopiových mRNA a virových RNA 104 washing detection