Preimplantační genetická diagnostika Preimplantační genetická diagnostika (PGD) * alternativa k prenatální diagnostice * alternativní prevence potratů indikovaných po amniocentéze * preventivní a cílená diagnostika dané geneticky dědičné nemoci * selekce embryí pro IVF u párů s rizikem transmitující genetické choroby Umělé oplodnění- in vitro fertilizace (IVF) nejrozšířenější metoda asistované reprodukce * z vaječníku se odebere několik vajíček * oplodní se spermiemi partnera in vitro * několik vybraných embryí se přenese do dělohy * dochází k implantaci a těhotenství K otěhotnění dochází v 25% případů na jeden cyklus léčby Průměrný počet dětí narozených po IVF je 15% na každý cyklus léčby Intracytoplasmická injekce testikulárních spermií (ICSI) Děti ze zkumavky Co předchází provedení PGD ? * Genetické poradenství před cyklem IVF - konzultace s párem včetně genetického vyšetření * Poradenství s gynekologem a embryologem * Informovaný souhlas pacientky Genetická analýza * oocyt/zygota (polární tělísko) * blastomera (embryo) * blastocysta Biopsie polárního tělíska (PB biopsie) * původně preferováno z etických důvodů (manipulace s oocyty , genetický materiál použitý k analýze není částí vyvíjejíciho se embrya) * komplikace: možnost rekombinace genotyp paternální alely zůstává neznámý * možnosti PB analýzy : detekce numerických chromozomálních abnormalit maternálního původu -- "age related" aneuploidie -- žena nositelka translokace * většina center PGD toto vyšetření nepreferuje Biopsie blastocyst * blastocysta: -- opouzdřená struktura obsahující přibližně 100 buněk -- vyvíjí se 5-6 den po inseminaci -- trofoektodermální buňky - odvozeny z placenty a jiných extra-embryonálních tkání -- odběr 10 buněk nepostihuje časný vývoj embryí, ale neví se jaký efekt ná na pozdější vývoj fetu -- pouze asi 40-50% preimplantovaných embryí se vyvine do tohoto stádia in vitro * výhoda: -- menší technická náročnost biopsie -- možnost více buněk k analýze Biopsie blastomer * 3.den fertilizované embryo: 6-8 totipotentních buněk * hlavní nevýhoda: -- limitované množství materiálu, doporučována biopsie a analýza dvou blastomer z každého embrya * většina center PGD preferuje biopsii blastomer Princip biopsie blastomer * Odběr blastomery z rýhujícího se embrya * Testování blastomery metodami molekulární biologie * Eliminace embryí se specifikovanou genetickou vadou Technika provedení biopsie blastomer * Fertilizace metodou ICSI * Biopsie po 72 hod. kultivace * Narušení zona pellucida * Odběr blastomer v EB mediu * Fixace blastomery na podložní sklo * Kultivace embryí po biopsii (48 hod.) * Oplach a transport blastomer v dest. vodě pro PCR vyšetření Diagnostika PGD * chromozomální abnormality: -- aneuploidie chromozomů X,Y, 13, 18, 21 -- chromozomální přestavby -- určení pohlaví -- FISH metoda * nevýhoda: častý výskyt chromosomálního mozaicismu * monogenní choroby -- pro jakoukoli genetickou chorobu u které je dostatečná sekvenční informace -- PCR * fenomén: allelic drop out (ADO) PGD chromozomálních abnormalit * chromozomy v interfázním jádře buňky * první PGD : FISH na X-vázané choroby (stanovení pohlaví) * většina chromozomálních abnormalit je maternálního původu - častá aplikace biopsie pólového tělíska (PB) * limitace: -- starší ženy nebo ženy s opakovaným IVF: limitovaný počet kvalitních embryí/oocytů (aneuplodie!) -- maximální počet chromozomů analyzovaných z jedné buňky je 7 - 9 -- chybné stanovení aneuploidie dosahuje až 15%, nejčastější příčinou chyb: * "background" fluorescence, slabý signál, ztráta jádra při aplikaci blastomery na podložní sklíčko * nyní zavádění CGH v PGD PGD monogenních chorob * genotypování jedné buňky založeno na metodě PCR -- komplikace : * možná kontaminace vzorku -- cumulus buňky, obklopující oocyt/maternální původ kontaminace -- spermie, zapuštěná do zony pelucidy pro fertilizaci/paternální kontaminace * ADO (alelic drop out) - amplifikace jedné alely pod úrovní detekovatelnosti -- optimalizace PCR (výskyt ADO <10%) -- příčina ADO: obecně neznámá, avšak je ovlivněna : << metodou buněčné lyse před PCR << PCR podmínkami << sekvencí cílové DNA << velikostí PCR produktu Minimalizace ADO * protokol monitorující výskyt ADO: -- multiplex PCR (dva a více lokusů vztažených ke genotypu) -- SSCP nebo DGGE analýzy ( detekující obě alely současně, potvrdí genotyp) -- fluorescenční PCR - redukuje výskyt ADO, detekce DNA fragmentu je až 1000x citlivější ve srovnání s konvenční PCR technikou Nevýhody PGD * Limitovaný počet buněk dostupných genetické analýze * Možné riziko narušení vývoje vyšetřovaného embrya * Není vyloučená jiná genetická vada * Doplnění PGD amniocentézou PGD u Cystické fibrózy * CF představuje nejčastější žádost o PGD -- incidence 1/2500 novorozenců * minoritní forma CF je způsobena kongenitální bilaterální absencí vas deferens (CBAVD) -- CBAVD nepostihuje spermatogenezi IVF + intracytoplasmická injekce testikulárních spermií (ICSI) -- jestliže partnerka je také nositelkou některé z mutací CFTR genu, pak ICSI procedura je následována PGD * 70% mutací CFTR genu v Evropské populaci : dF508 -- oba partneři nositelé dF508 (49%) -- jeden partner :dF508 a druhý jiná mutace (42%) (PGD zaměřena na eliminaci embryí nesoucích dF508 -- oba partneři nesou jinou mutaci než dF508 (9%) (specifický test na detekci mutací nebo nepřímá DNA dignostika) Identifikace alel * nepřímá DNA diagnostika: užití polymorfních míst v genu (haplotyp) -- jednoduchý a universální test pro všechny páry, jakmile je nalezena heterozygozyta polymorfního místa -- interní kontrola kontaminace vzorku -- dva a více polymorfních markerů snižuje riziko chybné interpretace (ADO) -- vyhodnotí status ploidie testované blastomery Fragmentační analýza dF508 z jedné buňky Využití PGD Etické problémy PGD