Bi8202c KURZ ZÁKLADŮ PROTEOMIKY
ČASOVÝ ROZVRH:
PONDĚLÍ 7:50- 7:55 Zahájení praktika (UKB, A2, 2.NP, místnost č. 211, Dr. Hejátko)
8:00 ­ 9:00 2-D elektroforéza ­ rehydratace proužků
9:00 ­ 9:30 Exprese rekombinantních proteinů ­ zaočkování expresní kultury
9:30 ­ 10:30 Úvod do experimentální části (přednáška)
9:30-9:40 2-D elektroforéza (Dr. Konečná)
9:40-9:45 MS analýza (Dr. Zdráhal)
9:45-10:30 Rekombinantní proteiny (Mgr. Fohlerová)
10:30 ­ 11:30 PAGE analýza ­ příprava gelů (SDS-PAGE, nativní PAGE)
11:30 ­ 12:30 OBĚD
12:30 ­ 13:30 Exprese rekombinantních proteinů ­ indukce
PAGE analýza ­ příprava gelů (SDS-PAGE, nativní PAGE)
13:30 ­ 15:00 In-solution proteolytické štěpení směsi proteinů pro LC-MSMS
analýzu
15:00 ­ 16:00 Struktura proteinů, proteomické databáze
16:00 ­ 17:00 Exprese rekombinantních proteinů ­ sklizeň kultury
Příprava noční kultury pro izolaci plazmidové DNA
17:00 ­ 18:00 1. rozměr 2-D elektroforézy: izoelektrická fokuzace (IEF)
ÚTERÝ 8:00 ­ 9:30 Izolace plazmidové DNA
9:30­ 10:00 Sekvenování - PCR
10:00 ­ 10:15 Ukončení in-solution proteolytického štěpení proteinů pro LC-
-MS/MS analýzu
Nasazení vzorků do autosampleru a začátek LC-MS/MS analýzy
10:15 ­ 11:30 2. rozměr 2-D elektroforézy: SDS-PAGE
11:30 ­ 13:00 OBĚD
13:00 ­ 15:30 Software pro vyhodnocování 2-D gelů, databáze 2-D gelů
Sekvenace DNA ­čištění vzorku (prostřídání skupin)
STŘEDA 7:30 ­ 8:30 In-gel proteolytické štěpení proteinů separovaných 2-D
elektroforézou
8:30-13:00 Optimalizace purifikace rekombinantních proteinů na Ni-NTA
Sepharose - příprava vzorku
- purifikace
Demonstrační chromatografie ­ POROS MC/M (BioCAD)
PAGE analýza rekombinantních proteinů - příprava vzorků
- SDS-PAGE analýza
Stanovení koncentrace proteinů metodou dle Bradfordové
13:00 ­ 14:00 OBĚD
14:00 ­ 15:00 Sekvenování DNA ­ vyhodnocení výsledků
ČTVRTEK 7:30 ­ 9:00 Nativní PAGE analýza
9:00 ­ 11:00 Analýza proteomu ­ identifikace proteinů metodou MALDI-TOF
MS (ukončení in-gel proteolytického štěpení proteinů separovaných
2-D elektroforézou a analýza vzorků MALDI-TOF hmotnostní
spektrometrií)
11:00 ­ 13:00 Ukončení nativní PAGE ­ aktivitní barvení (MUG)
- Western blotting
13:00 ­ 14:00 OBĚD
14:00 ­ 16:30 Western blotting
Analýza obrazu ­ denzitometrická měření (čistota purifikovaných
Dle dohody proteinů)
Vyhodnocení sekvenování DNA, čtecí rámec (Work Bench)
PÁTEK 8:00 ­ 10:00 Vyhodnocení výsledků LC-MSMS a MALDI-TOF MS analýz
10:00 ­ 12:00 Test + "dodělávky" (vyhodnocení sekvencí a čistoty purifikovaného
vzorku)
12:00 ­ 13:00 OBĚD
13:00 ­ 17:00 Vypracování a odevzdání protokolů
Cvičící (legenda): 2-D a příprava pro MS Dr. Konečná
Analýza obrazu Mgr. Urbánková
MS analýza Dr. Zdráhal
Struktura proteinů Mgr. Mazura
Exprese a purifikace rekombinantních proteinů Mgr. Fohlerová
Martina Válková
Izolace a purifikace DNA, práce s WorkBench Dr. Nejedlá
Sekvenování DNA Mgr. Paděrová