M A S A R Y K O V A U N I V E R Z I T A Přírodovědecká fakulta Ústav experimentální biologie Brno BIOREMEDIACE RNDr. Dana Horáková, CSc. 2006 2 Několik slov úvodem S vývojem a využíváním vysoce citlivých analytických metod se ukazuje, že vzduch, který dýcháme, voda, kterou pijeme nebo se v ní koupeme, půda, ve které pěstujeme plodiny a prostředí, ve kterém žijí populace živočichů a rostlin, jsou kontaminovány nejrůznějšími syntetickými látkami, jejichž syntéza úzce souvisí s intensifikací antropogenní činnosti.V zemědělsky využívané půdě a ve spodních i povrchových vodách, které se zemědělskou činností souvisejí, se jedná zejména o kontaminaci pesticidy nebo produkty, které jsou od pesticidů odvozeny. Právě hromadění pesticidů v půdě dalo podnět pro intezivní studium jejich odstranění. Vedle pesticidů se však celá řada dalších průmyslově vyráběných sloučenin dostává do odpadních vod a půdy, a to především nedbalostí při jejich výrobě či jejich skladování. V kontaminovaném prostředí pak dochází nejčastěji k jejich samovolnému rozpadu, přičemž vznikají nejrůznější nové a většinou těžce analyzovatelné sloučeniny, které velmi často reagují s přírodní organickou hmotou. Lze předpokládat, že znečišťující látky se v přírodě jen velmi zřídka vyskytují ve své původní čisté a chemicky definované formě, ale spíše ve formách chemicky často velmi vzdálených od struktury původní sloučeniny nebo dokonce v komplexech nebo více či méně složitých směsích. Počet takto vznikajících směsí a komplexů je nevyčíslitelný, neboť množství chemikálií, které kontaminují naše životní prostředí je enormní. Rovněž koncentrace těchto kontaminujících látek může být v prostředí velmi variabilní. V místech přímého znečištění se setkáváme s kontaminací přesahující koncentraci 1.0 g /l vody či 1 g/kg půdy, tedy vyšší než 1000 ppm. Ve větších vzdálenostech od místa přímého znečištění jsou sice koncentrace kontaminujících látek (polutantů) podstatně nižší, avšak i v těchto velmi slabě znečištěných lokalitách můžeme zaznamenat jejich toxické působení, neboť se dlouhodobě akumulují ve zvířatech, rostlinách i v lidském organizmu. Nelze rovněž opomenout, že celá řada chemikálií se uvolňuje do ovzduší, kde může být nejrůznějším způsobem modifikována a spolu se srážkovou činností se dostává do značných vzdáleností od vlastního místa znečištění. Je tedy zřejmé, že předpovídat rizikové působení různých organických sloučenin na zdraví člověka, zvířat a rostlin je velmi obtížné a nemůže být založeno jen na jejich toxicitě, ale i na době exposice organizmu jejich působení a na změnách, které mohou sloučeniny prodělávat v potravním řetězci nebo během jejich transportu v přírodě. Celá řada organických molekul podléhá v přírodě abiotickému rozkladu. Např. fotochemické transformace se uskutečňují v atmosféře, v blízkosti vodní hladiny, při povrchu půdy a rostlinného pokryvu a mohou nejen některé látky modifikovat, ale i totálně rozkládat. Nefotochemické, neenzymatické reakce převažují v půdě, sedimentech a v povrchových i spodních vodách, ale jen zřídkakdy v průběhu těchto reakcí dochází k úplné mineralizaci kontaminujících organických látek. Tyto procesy většinou vedou k pouhé modifikaci polutantu, přičemž vznikající produkty jsou nejen chemicky velmi příbuzné, ale často si zachovávají i stejné toxické vlastnosti jako výchozí látka. Naproti tomu, enzymatické biologické procesy vedou ke značným změnám organických molekul, a to nejen v místě jejich přímé kontaminace ve vodě či v půdě, ale i v potravních řetězcích. Četné biotické procesy se mohou podílet na úplné konverzi organické látky v látku anorganickou, tedy na procesu mineralizace. Nejsou však výjimkou případy, kdy organická látka může být v biologickém procesu pouze modifikována , a to nejen strukturálně, ale i v toxikologických vlastnostech. V těchto biotických procesech se uplatňují jak rostliny, tak i živočichové, ale převaha biotických změn je uskutečňována mikroorganizmy, které kontaminované prostředí osidlují. V úvodní kapitole jsme naznačili, že složitá problematika biodegradací a bioremediací vyžaduje více, než je znalost jednoho či dvou vědních disciplin. Celá řada chemických přeměn kontaminujících látek je uskutečňována mikroorganismy, jejichž metabolický potenciál je předmětem studia mikrobiologie. Vznikající produkty jsou izolovány a kvantifikovány vysoce specifickými chemickými metodami. O škodlivosti kontaminujících látek a vznikajících produktů vypovídají studie ekologů a ekotoxikologů. Studiu kontaminovaných lokalit a návrhu technického řešení pro jejich dekontaminaci se věnují geologové, hydrogeologové a obory ekologického inženýrství. Lze tedy říci, že toto skriptum je adresováno mikrobiologům, chemikům, toxikologům, ekologům, stejně tak jako i všem, kteří se zabývají a řeší problematiku ekologického inženýrství. RNDr. Dana Horáková, CSc. 3 OBSAH BIODEGRADACE ................................................................................................................... 5 Bioremediace......................................................................................................................... 6 Fertilizace............................................................................................................................ 6 Seeding................................................................................................................................ 6 BIODEGRADACE VÁZANÁ NA RŮST MIKROORGANIZMŮ......................................... 8 Asimilace uhlíku ................................................................................................................... 9 Asimilace jiných prvků ....................................................................................................... 10 PŘIZPŮSOBENÍ..................................................................................................................... 11 Faktory ovlivňující přizpůsobení ........................................................................................ 12 Vysvětlení pro vznik fáze přizpůsobování.......................................................................... 13 Zmnožení malé populace degradujících mikroorganizmů................................................ 13 Přítomnost toxinů (toxikantů) ........................................................................................... 14 Predace protozoi................................................................................................................ 14 Vznik nových genotypů .................................................................................................... 15 Diauxie .............................................................................................................................. 15 ENZYMOVÁ INDUKCE A LAG FÁZE............................................................................... 16 BIOTRANSFORMACE.......................................................................................................... 17 Detoxikace polutantu (detoxifikace) ................................................................................... 17 Stručný přehled detoxikačních procesů............................................................................. 18 Aktivace netoxického polutantu.......................................................................................... 20 Významné mechanizmy aktivace...................................................................................... 21 RIZIKA BIODEGRADACE................................................................................................... 23 KINETIKA BIODEGRADACE ............................................................................................. 24 Procesy vázané na růst buněk.............................................................................................. 24 Biodegradace nerostoucími mikroorganizmy ..................................................................... 27 Vliv difúze a sorpce............................................................................................................. 30 KOMETABOLIZMUS ........................................................................................................... 32 Enzymy s nízkou substrátovou specifitou........................................................................... 33 PRAHOVÉ KONCENTRACE POLUTANTU ...................................................................... 36 BIOLOGICKÁ DOSTUPNOST POLUTANTŮ.................................................................... 39 Sorpce.................................................................................................................................. 40 Chemická podstata sorpce................................................................................................. 40 Využívání sorbovaných sloučenin ...................................................................................... 42 Kinetika ............................................................................................................................. 43 Stimulační efekt sorpce ....................................................................................................... 43 ,,Stárnutí" polutantu............................................................................................................. 44 BIODEGRADACE LÁTEK S NÍZKOU ROZPUSTNOSTÍ VE VODĚ............................... 45 BIOSURFAKTANTY............................................................................................................. 48 VLIV CHEMICKÉ STRUKTURY NA BIODEGRADACI .................................................. 50 Predikce produktů ............................................................................................................... 51 VLIV PROSTŘEDÍ NA PRŮBĚH BIODEGRADACE ........................................................ 52 Abiotické faktory................................................................................................................. 52 Živiny v procesu biodegradace ........................................................................................... 53 Synergizmus........................................................................................................................ 53 Podíl predace na výsledcích biodegradace.......................................................................... 54 Podíl vyšších rostlin na biodegradaci.................................................................................. 54 Aerobní a anaerobní procesy biodegradace......................................................................... 55 4 BIODEGRADACE NĚKTERÝCH VÝZNAMNÝCH ORGANICKÝCH POLUTANTŮ... 55 Biodegradace ropy a ropných derivátů v ekosystému......................................................... 55 Biodegradace uhlovodíků.................................................................................................... 58 Mikrobiální transformace karboxylových kyselin a alkoholů............................................. 60 Metylace a tvorba éterů....................................................................................................... 61 Halogenované sloučeniny ................................................................................................... 61 Polychlorované bifenyly (PCBs)......................................................................................... 62 BIOREMEDIACE TĚŽKÝCH KOVŮ .................................................................................. 62 Bioakumulace a biosorpce................................................................................................... 63 Biosorpční izoterma .......................................................................................................... 64 Mechanizmus biosorpce.................................................................................................... 64 BIOTRANSFORMACE NĚKTERÝCH TĚŽKÝCH KOVŮ ................................................ 67 Rizika plynoucí z biotransformace kovů............................................................................. 69 PŘÍSTUPY K SANACI ZNEČIŠTĚNÉHO PROSTŘEDÍ A VYMEZENÍ NĚKTERÝCH POJMŮ.................................................................................................................................... 69 Vybrané skupiny kontaminantů .......................................................................................... 69 Vlastnosti vybraných kontaminantů.................................................................................... 70 Vlastnosti a chování organických těkavých látek (TOL).................................................. 70 Vlastnosti a chování částečně (obtížně) těkavých organických polutantů........................ 71 Vlastnosti a chování vybraných anorganických kontaminantů......................................... 72 Podíl vlastností horninového prostředí na výběr sanačních metod..................................... 73 NEJPOUŽÍVANĚJŠÍ SANAČNÍ TECHNOLOGIE.............................................................. 73 Konvenční sanační technologie........................................................................................... 73 Bioremediační technologie.................................................................................................. 74 Biodegradace kontaminované půdy ex situ....................................................................... 76 Biodegradace kontaminované půdy a spodní vody in situ................................................ 78 Technologie biologického čištění spodních vod ( in situ biorestoration). ........................ 79 Biofiltry ............................................................................................................................. 79 Biologické odstraňování kovů........................................................................................... 80 CHEMICKÁ ČASOVANÁ BOMBA (CTB) ......................................................................... 80 Použitá literatura ..................................................................................................................... 82 5 BIODEGRADACE Biodegradace může být definována jako biologicky katalyzované snížení komplexity chemických sloučenin. Organické sloučeniny jsou v procesu biodegradace velmi často zcela rozloženy, takže vznikají anorganické sloučeniny uhlíku, dusíku, fosforu, síry a jiných prvků obsažených v původní kontaminující organické látce a tyto jsou uvolňovány do prostředí a zařazeny do koloběhu prvků v přírodě. Lze tedy říci, že tato úplná biodegradace toxické organické látky, která je známá pod pojmem mineralizace, je přírodě velmi prospěšná. Ve své podstatě respirace rostlin a živočichů je rovněž mineralizačním procesem, ve kterém dochází k rozkladu celé řady organických látek v živém organizmu. Syntetické organické látky jsou však nejčastěji rozkládány již přímo v kontaminovaném prostředí osídleném mikroorganizmy s rozsáhlou metabolickou aktivitou. Vedle těchto biologických přeměn kontaminujících organických látek dochází ke snížení jejich komplexity rovněž působením celé řady abiotických procesů. Účinnost těchto abiotických procesů je však jen těžko srovnatelná s vysokou účinností biologické přeměny. Mikroorganizmy jsou tedy nejvýznamnějším faktorem, který se podílí na mineralizaci antropogenických sloučenin v půdě, ve vodě a v sedimentech. Celá řada syntetických sloučenin, které jsou zavlečeny do prostředí, je vysoce toxická nejen pro člověka a zvířata, ale i pro mikroorganizmy. Z tohoto důvodu nemusí dojít v prostředí k jejich úplné destrukci, tedy k mineralizaci. Často jsou však pozorovány abiotické, popř. i biologické, tzv. transformační procesy, které vedou k tvorbě nových organických látek vznikajících konverzí původní organické toxické látky. Produkt této transformace se obvykle v prostředí hromadí a dlouhodobě perzistuje. Všeobecně je tedy abiotická či biologická transformace organických polutantů nežádoucí, neboť vytváří novou, většinou po chemické a toxikologické stránce neznámou kontaminaci. Odhalení nově vzniklého rizika ve vztahu ke zdraví člověka , zvířat a rostlin vyžaduje často značně nákladné hledání nových chemických a ekotoxikologických metod. Omezení detekovatelného rizika podmiňuje projekt sanačních opatření, na kterém se podílejí jak ekotechnologové, tak i mikrobiologové . Mikrobiální degradace je procesem historickým. Tisíce látek, které byly připraveny člověkem v laboratořích, může být mikrobiologicky modifikováno nebo rozloženo v přirozeném prostředí. Degradační procesy byly pozorovány v kontaminovaných půdách a odpadních vodách, na skládkách, ve spodních i povrchových vodách, oceánech a sedimentech nejrůznějšího původu. Bylo prokázáno, že na degradaci polutantů v těchto prostředích se významnou měrou podílejí rozsáhlé mikrobiální komunity bakterií, hub a protozoí, které přímo nebo nepřímo rozkládají a využívají jak řadu přirozených organických látek, tak i celou řadu syntetik. Degradační procesy, ve kterých mikroorganizmy využívají organické látky , mohou být aerobní i anaerobní. K tomu, aby se uskutečnila biodegradace organického polutantu v kontaminovaném prostředí, musí být však splněny určité předpoklady, za kterých dojde k transformaci či mineralizaci organické látky: Musí existovat organizmus, který produkuje vhodné enzymy pro uskutečnění určité cílené biodegradace. Pouhá existence takového organizmu s odpovídajícím katabolickým potenciálem je sice nutná, ale pro uskutečnění biodegradace není dostačující. Takto vybavený organizmus musí být přítomný v kontaminovaném prostředí. Je známo, že mikroorganizmy osidlují prakticky každé fyziologicky vhodné prostředí, avšak nemusí být vždy přítomen organizmus s vhodným enzymatickým vybavením. 6 Organický polutant musí být pro organizmus s vhodným katabolickým potenciálem dostupný. Je známa celá řada organických látek, které v prostředí perzistují i za přítomnosti degradujících mikroorganizmů, neboť jsou nerozpustné ve vodě či sorbované na pevné povrchy. Organizmy s katabolickým potenciálem musí poskytovat možnost penetrace polutantu či transformačních produktů přes membránu, neboť biodegradace bývá uskutečňována jak extracelulárními , tak i intracelulárními enzymy. Populace nebo biomasa degradujících bakterií či hub osidlujících přirozené prostředí bývá pro uskutečnění biodegradace nebo transformace polutantu často nedostatečná. Z tohoto důvodu je vhodné upravit fyziologické podmínky kontaminovaného prostředí tak, aby dovolily rychlé množení potenciálně aktivních mikroorganizmů. Můžeme tedy shrnout, že pokud organické znečištění v prostředí perzistuje, pak nebyla splněna některá z výše uvedených podmínek pro umožnění jeho eliminace nebo že degradace probíhá velmi pomalu nebo že neexistuje organizmus s odpovídající degradační kapacitou. Bioremediace je variantou biodegradace. Proces biodegradace se týká všech přirozených procesů, které jsou uskutečňovány bakteriemi a jinými mikroorganizmy či vyššími organismy, které vedou k destrukci organických molekul. Proces bioremediace spočívá v akceleraci těchto přirozených biodegradačních procesů nebo v přísně cílené biodegradaci. Procesy bioremediace snižují rizika nežádoucí přirozené transformace kontaminujících látek a rizika perzistence neznámých transformačních produktů v prostředí. Bioremediace je tedy biodegradační metodou, která vede k ozdravení kontaminovaného prostředí. Bioremediace může být na základě znalostí podmínek prostředí, jeho mikrobiálního osídlení a charakteru znečištění uskutečňována dvěmi základními metodami: Fertilizace je bioremediační metoda, která spočívá v akceleraci již probíhajících pomalých biodegradačních procesů , uskutečňovaných přirozeně se vyskytující mikroflórou. Nejčastěji spočívá ve stimulaci růstu vhodných degradátorů přídavkem zdrojů dusíku a fosforu, popř. růstových faktorů či induktorů specifických enzymů. Seeding spočívá v obohacení kontaminovaného prostředí degradátory se známým kabolickým potenciálem. Spolu s těmito mikroorganizmy mohou, ale nemusí být aplikovány i potřebné živiny a růstové faktory. Bioremediace uskutečňovaná metodou seeding je prováděna nejčastěji s mikroorganizmy isolovanými z přirozeného prostředí. V procesu bioremediace­ seeding zatím nejsou využívány geneticky modifikované mikroorganizmy, i když v laboratorních podmínkách jsou tyto mikroorganizmy konstruovány a využívány pro studium degradačních procesů a konstrukci degradačních drah. 7 ANTROPOGENNÍ ČINNOST Těžba a zpracování surovin Průmyslová výroba Skladování Zemědělství Domácí odpad kontaminace PŮDA VODA VZDUCH DEGRADACE Abiotická Biologická MODIFIKACE TOTÁLNÍ ROZKLAD TRANSFORMACE (TOTÁLNÍ ROZKLAD ?) BIODEGRADAČNÍ PROCESY (Biologicky katalyzované snížení komplexity chemických látek) TOTÁLNÍ BIODEGRADACE MIKROBIÁLNÍ TRANSFORMACE (mineralizace) 8 BIODEGRADACE VÁZANÁ NA RŮST MIKROORGANIZMŮ Mikroorganizmy vyžadují celou řadu přirozených organických a anorganických látek, které využívají jako zdroj uhlíku,energie,dusíku, fosforu, síry nebo jiných prvků nutných pro život buňky. Největší pozornost je však zaměřena na studium zdrojů uhlíku a energie, neboť organické uhlíkaté látky patří mezi nejzávažnější kontaminanty životního prostředí. Schopnost mikroorganizmů využívat organický substrát jako zdroj uhlíku a energie pro růst je prokazatelná laboratorně tzv. enrichment-culture technique. Tato metoda je založena na selektivním využívání jednotlivých testovaných organických sloučenin jako zdroje C a energie pro růst studovaného mikroorganizmu, přičemž růst mikroorganizmu je sledován v prostředí obsahujícím všechny nutné anorganické živiny, ale žádný jiný zdroj uhlíku a energie. Za těchto podmínek je studovaný mikroorganizmus (degradující druh či kmen) schopný růst jen tehdy, jestliže testovanou organickou látku využívá a tedy i degraduje. Při testování přirozených mikrobiálních populací se jen velmi málo bakterií a hub může za podmínek tohoto jednoduchého pokusu množit. Přesto opakovaná selekce a nahromadění degradujících mikroorganizmů s mikroorganizmy. Technika obohaceného syntetického prostředí však může být i neúspěšná, neboť se experimentátor může dopustit některých závažných chyb, které nenavozují vhodné růstové podmínky pro mikroorganizmy s hledaným degradačním potenciálem. Nejčastější chybou bývá nevhodně zvolená koncentrace studované organické látky . Velmi nízké koncentrace organické látky mohou být nedostačující pro množení buněk degradujícího mikroorganizmu, naopak příliš vysoké koncentrace organické látky mohou být i pro degradující mikroorganizmy toxické. Příčinou neúspěchu v izolaci degradujících mikroorganizmů bývá i nevhodné použití selektivního media, které často postrádá esenciální růstové faktory pro jejich růst. Nejčastěji však neúspěšná izolace mikroorganizmů s degradačním potenciálem přímo souvisí s dlouhodobou perzistencí některých organických látek v přírodě. Tyto neúspěšné izolace mohou být pak důkazem, že studovaná organická látka nemůže být ani za vhodně zvolených fyziologických podmínek využívána pro růst a množení mikroorganizmů jako zdroj uhlíku a energie. Proces biodegradace organických látek v přírodě je velmi často vázán na růst mikroorganizmů, což se projevuje zvýšením počtu bakteriálních buněk nebo biomasy hub v prostředí.V případě, že se skutečně jedná o využívání organického znečištění jako zdroje uhlíku a energie pro růst mikroorganizmů, musíme současně pozorovat významné snižování koncentrace testované organické látky. Vymizení tohoto zdroje uhlíku a energie pak následně vede k poklesu počtu buněk či snížení biomasy degradujících mikroorganizmů. Pokud se koncentrace testované organické látky významně nemění, pak lze uzavřít, že pro růst mikroorganizmů byl využit jiný zdroj uhlíku a energie, např. jiné buněčné nebo tkáňové složky živých organizmů. Pro biodegradaci, která je vázaná na růst mikroorganizmů, bývá charakteristická mineralizace organického substrátu. Organický substrát je přeměňován až na CO2, složky buňky a na produkty, které jsou typické pro danou katabolickou dráhu. V přirozeném prostředí však mineralizace nemusí být vždy vázána na růst buněk a naopak, produkce CO2 nemusí být u nerostoucí populace vždy vázána na mineralizaci sledovaného organického substrátu. V přirozeném prostředí je vždy nutné vidět produkci CO2 ve vzájemném komplexním působení více mikrobiálních druhů, které společně mohou uskutečňovat velmi pomalou mineralizaci polutantu. 9 Organické znečištění prostředí reprezentuje pro přirozeně se vyskytující heterotrofní mikroorganizmy vhodný či méně vhodný zdroj uhlíku a energie. Mikroorganizmy mohou pak na daném zdroji uhlíku růst , jestliže organická látka je degradována jejich hlavními metabolickými drahami. Jen tyto katabolické dráhy jim zajišťují dostatek materiálu a energie pro biosyntetické procesy. Pokud organické znečištění nemůže být atakováno enzymatickým vybavením mikroorganizmu, pak nemůže sloučenina sloužit ani jako zdroj uhlíku a energie a biosyntetické pochody v buňce neprobíhají. Velmi často postačí, aby tato neobvyklá kontaminující látka byla pozměněna např. abioticky nebo enzymem jiného mikroorganizmu na využitelný substrát v hlavních metabolických drahách degradátora. Příkladem využívání organického substrátu jako zdroje uhlíku a energie s využitím ,,enrichment-culture technique" mohou být bakterie metabolizující 4-nitrofenol (PNP). Růst degradujícího mikroorganizmu je současně doprovázen plynulým poklesem koncentrace metabolizovatelného uhlíkatého substrátu ve vodném prostředí. (Obr.1). Asimilace uhlíku Během mikrobiální degradace uhlíkatého substrátu je určité procento uhlíku asimilováno a stává se součástí buňky, tedy podílí se na vytváření buněčné biomasy. Stanovení tohoto procenta uhlíku zabudovaného do biomasy je poměrně jednoduché v tekutých definovaných mediích s přídavkem uhlíkatého substrátu, který je rozpustný ve vodě. Mnohem komplikovanější je stanovení procenta asimilovaného uhlíku při degradaci organických kontaminant v půdě, odpadní vodě, v kalech nebo sedimentech. Obtíže stanovení způsobuje přítomnost organických zbytků a také častá tvorba komplexních produktů nerozpustných ve vodě, které musí být odlišeny od nově vytvářeného buněčného materiálu. Za asimilovaný uhlík lze považovat všechen uhlík substrátu po odečtu uhlíku, který byl buňkou mineralizován. C asimilovaný = C substrátový - C mineralizovaný Obr.1 Růst bakterií degradujících 4-nitrofenol ( 2 ppm) Podle Wiggins a kol., 1987 0 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Dny LogCFU/ml 0 20 40 60 80 100 120 Zbytek4-nitrofenolu(%) PNP buňky 10 Také asimilovaný uhlík je však v průběhu metabolizmu buňky rovněž mineralizován nebo se dostává do buněk protozoí nebo jiných predátorů.V laboratorních měřeních při práci s čistými kulturami buněk je asimilace uhlíku často vyjadřována tzv. růstovým výtěžkem, který udává množství vytvořené biomasy na váhovou jednotku využitého substrátu. Asimilace může být vyjádřena rovněž molárním růstovým výtěžkem, který představuje váhu biomasy vytvořené metabolizací jednoho molu substrátu. Tyto hodnoty jsou velmi variabilní a podstatně odlišně zejména v porovnání asimilace u aerobů a anaerobů. Za určitých podmínek může být uhlík ze substrátu zcela mineralizován . K tomuto jevu dochází zejména při nízkých koncentracích substrátu. Za těchto podmínek jinak asimilovatelný uhlíkatý substrát zřejmě slouží pro buňku pouze k zachování energie a životaschopnosti. Rychlá respirace buněk může však vést i k jejich rozkladu a postupně k celkové mineralizaci. V kontrastu k těmto pozorováním byla prokázána existence uhlíkatých látek, které mohou být za určitých podmínek akumulovány do biomasy i v případě, že se v prostředí vyskytují ve velmi nízkých koncentracích. Nebylo však prokázáno, že buňky vedle tohoto asimilovaného uhlíkatého substrátu nevyužívají navíc jiný uhlíkatý substrát z prostředí, který nebylo možné identifikovat ( např.odumřelé buňky). Nemůžeme proto zobecnit, že procento mineralizace vzrůstá nebo klesá se vzrůstající koncentrací degradované látky v prostředí. Procento uhlíkatého substrátu, který je buď asimilován nebo mineralizován závisí často na druhu mikroorganizmu, který byl použit k transformaci, na typu využívaného substrátu, na teplotě a pravděpodobně i na jiných faktorech prostředí, v němž biodegradace probíhá. V přirozených společenstvech jsou buňky, které mohou využívat kontaminující organický substrát, často rozloženy jinými druhy mikroorganizmů nebo jsou konzumovány protozoi a jinými predátory. V tomto procesu značně klesá sumárně v celém společenstvu procento uhlíku asimilovaného do jeho biomasy a současně v čase vzrůstá procento mineralizace. Můžeme shrnout, že zejména za přítomnosti kyslíku v prostředí, jsou počáteční procesy významným odrazem aktivity mikrobiální populace specificky degradující uhlíkatý substrát, zatímco postupně s časem, tyto procesy odrážejí aktivitu celé přirozené komunity mikroorganizmů kontaminovaného prostředí. Procesy mineralizace biomasy degradátorů a jejich produktů probíhají v přirozeném prostředí velmi pomalu. Z toho můžeme usoudit, že většina uhlíku z degradovaného substrátu zůstává v prostředí ve formě vysokomolekulárních komplexů, které jsou velmi odolné k rychlé biodegradaci. Asimilace jiných prvků Celá řada kontaminujících látek může sloužit nejen jako zdroj uhlíku a energie, ale i jako zdroj jiných prvků. Nejčastěji se jedná o využití kontaminující látky jako zdroje N,P,S nebo stopových prvků pro růst degradátora v prostředí. Příkladem může být využívání 2,6- dinitrofenolu buňkami studovaného kmene Pseudomonas sp..Tento mikroorganizmus využívá 2,6-dinitrofenol jako zdroj dusíku. V první fázi degradace bylo pozorováno odštěpení nitritu s následnou redukcí na NH3, který umožňuje množení mikroorganizmu. (Brujn a kol., 1987). Byla popsána celá řada mikroorganizmů degradujících herbicidy a insekticidy, kteří využívají tyto látky převážně jako zdroj fosforu. Rovněž některé sirné organické polutanty mohou sloužit pro některé degradátory jako zdroj síry. Bylo však pozorováno, že i když některé organické látky obsahují nejrůznější růstové prvky, bývá mikroorganizmem využíván pouze jeden z nich. Pro heterotrofní mikroorganizmy, které osidlují přirozené prostředí, zůstává však limitujícím prvkem uhlík, i když při odpovídající koncentraci N,P,S a jiných stopových prvků. Tyto mikroorganizmy však nejčastěji využívají uhlíkatou kostru organického polutantu jako zdroj uhlíku a energie, přičemž tento proces nutně vede k současné mineralizaci jiných organicky vázaných prvků. 11 PŘIZPŮSOBENÍ Degradaci široké škály organických sloučenin předchází období, ve kterém nedochází k jejich zjevné destrukci. Tento časový interval je označován jako období přizpůsobování (acclimation period) nebo také fáze adaptace nebo lag fáze. Toto období můžeme definovat jako časový úsek, který uplyne od okamžiku kontaminace prostředí určitou chemikálií až do prvního prokazatelného úbytku této látky. Během tohoto období nelze v koncentraci polutantu pozorovat žádné průkazné změny. Toto období bývá vystřídáno rychlým poklesem koncentrace kontaminující látky (Obr.2). Obr.2 Biodegradace polutantu s fází přizpůsobení 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 Měsíce Zůstatekpolutantuvprostředí(%) Období přizpůsobení Degradace Fáze přizpůsobení může být pro člověka, zvířata i rostliny velmi nebezpečná, protože po toto období zůstává látka v prostředí beze změny a riziko jejího toxického působení vzrůstá. Mimo to v tomto období se může látka šířit do povrchových nebo spodních vod. Zejména ve spodních vodách pak kontaminant může přetrvávat, neboť pravděpodobnost jeho degradace v tomto prostředí je mizivá. Horizontální šíření polutantu může navíc zcela neočekávaně ohrožovat zdraví člověka a zvířat i v lokalitách značně vzdálených od místa primární kontaminace. Období přizpůsobení bylo pozorováno po kontaminaci nejrůznějšími syntetickými organickými látkami a to v půdě, ve vodním prostředí, v sedimentech i kalech. Délka období přizpůsobení je velmi variabilní a kolísá od několika hodin až po řadu měsíců. Délka tohoto období je silně ovlivněna jak chemikálií samotnou a její koncentrací, tak i podmínkami prostředí (teplota, provzdušnění, přítomnost živin a stopových prvků, popř. jiných, často těžce definovatelných faktorů). Za anaerobních podmínek bývá tato fáze přizpůsobení poměrně delší v porovnání s podmínkami aerobními. Všeobecně je však nutné si uvědomit, že predikce doby přizpůsobení je velmi obtížná a namnoze zcela nemožná. Po období přizpůsobení může následovat pomalá nebo naopak rychlá biodegradace kontaminující látky. Všeobecně však platí, že pokud dojde k opakované kontaminaci prostředí degradovanou látkou již po ukončeném období přizpůsobení, pak následující druhé období přizpůsobení se výrazně zkracuje nebo dokonce chybí. Zkrácení nebo vymizení období přizpůsobení po opakované kontaminaci je vysvětlováno dostatečným počtem buněk degradujících mikroorganizmů vytvořených v průběhu primárního využívání polutantu. Rychlost degradace kontaminující látky bývá však namnoze i po druhé aplikaci téže chemikálie stejná, i když někteří autoři uvádějí , že může být i podstatně vyšší v porovnání s první aplikací , kterou charakterizuje perioda přizpůsobení. 12 Jestliže po první aplikaci chemikálie vzroste počet degradujících buněk dvakrát, pak by se při konstantní rychlosti její degradace, vztažené na jednu buňku, měla zkrátit doba potřebná na degradaci určitého množství této látky přibližně na jednu polovinu. Jestliže vzroste počet buněk třikrát, pak na jednu třetinu atd. Ve skutečnosti však velký počet degradujících buněk je v prostředí konzumován protozoii a jinými predátory, takže nedochází k jejich plynulému nárůstu v kontaminovaném prostředí. Je tedy pravděpodobné, že pokud po dalším přidání polutantu bude biodegradace probíhat vyšší rychlostí, tak za toto zvýšení nebude zodpovědný jen nárůst populace degradujících mikroorganizmů, ale také jejich zvýšená metabolická aktivita. O tom, jak dlouho přetrvává toto metabolické ,,naladění" buněk, se vedou dosud diskuze. Všeobecně je však známo, že po ukončení degradace polutantu ztrácejí degradující mikroorganizmy postupně svoji aktivitu a současně dochází k poklesu počtu buněk nebo biomasy. Pro různé organické látky je délka tohoto období velmi variabilní. Namnoze autoři usuzují, že rozhodující podíl na ztrátě životaschopnosti buněk má snížení jejich metabolické aktivity pro nedostatek některých ,,specifických" látek. Faktory ovlivňující přizpůsobení Období přizpůsobování mikrobiálního společenstva jednomu substrátu bývá doprovázeno současným přizpůsobováním se i látkám jiným, i když ne všem, ale především látkám příbuzným. Příkladem může být metabolizmus příbuzných látek po období přizpůsobení mikroorganizmů k degradaci fenolu ve vodě. Experimentálně bylo prokázáno, že tyto mikroorganizmy pak velmi dobře metabolizují následně přidaný 4-chlorofenol, 3-aminofenol a m-kresol. Podobně se přizpůsobení mikrobiální populace k benzenu projevuje ve zvýšení rychlosti transformace různých polycyklických aromatických sloučenin. Toto zjištění neplatí však pro degradaci různých sloučenin ve směsích, kde naopak může dojít k prodloužení období aklimatizace mikrobiálních společenstev a nastupující degradace některých kontaminant může být velmi pomalá nebo se vůbec nemusí uskutečnit, ačkoliv jednotlivé složky mohou být společenstvem degradovány. Významným faktorem, který ovlivňuje délku doby přizpůsobování, je teplota prostředí. Období přizpůsobení se prodlužuje zejména v nízkých teplotách. Délku tohoto období ovlivňuje dále hodnota pH a přítomnost kyslíku v prostředí. V povrchových vodách mohou limitovat růst degradujících mikroorganizmů koncentrace dusíku a fosforu . Bylo však prokázáno, že v půdách může dojít k degradaci dusíkatých nebo fosfátových organických sloučenin až po velmi dlouhém období, neboť degradující mikroorganizmy využívají z prostředí přednostně anorganické zdroje dusíku a fosforu. Na délce období přizpůsobení se podílí i koncentrace kontaminující organické látky. Ani velmi citlivé analytické metody však nedovolují precizní posouzení délky období přizpůsobení pro látku, která kontaminuje prostředí ve velmi nízké koncentraci. Bylo však prokázáno, že v rozmezí těchto relativně nízkých koncentrací látky se sebemenší zvýšení její koncentrace v prostředí projevuje rovněž zvýšením rychlosti její degradace. Naopak při kontaminaci prostředí vysokými koncentracemi polutantu musíme vždy počítat s poměrně dlouhou dobou aklimatizace degradujících mikroorganizmů. Další výzkumy však prokázaly, že délka období přizpůsobení není závislá jen na chemickém složení kontaminující látky a její koncentraci v prostředí. Rozhodujícím faktorem může být i lokalita samotná se specifitou degradujících mikrobiálních společenstev. Zkracování nebo vymizení fáze přizpůsobení s následnou akcelerací degradace může být vážným problémem při každoroční aplikaci některých ochranných látek v zemědělství. Tyto látky, zejména herbicidy a insekticidy, se stávají díky jejich zrychlené biodegradaci v doporučených dávkách neúčinné. Tento fakt vede zemědělce ke zvyšování aplikovaného 13 množství herbicidu. Výsledkem této neuvážené aplikace herbicidu bývá namnoze vznik náhlé perzistence těchto látek v prostředí a jejich neúměrná koncentrace v zemědělských produktech. Na základě výsledků laboratorních i polních experimentů se předpokládá, že zvýšení rychlosti degradace pesticidů a herbicidů není závislé na zmnožení degradujících buněk či biomasy, ale spíše na zvýšení metabolické aktivity jednotlivých buněk. Vysvětlení pro vznik fáze přizpůsobování Vysvětlení tohoto fenoménu je velmi mnoho. Většinou však k vysvětlení sloužily laboratorní experimenty s čistými kulturami a přirozenými substráty. Je tedy zřejmé, že za těchto podmínek nelze závěry těchto experimentů aplikovat bez výhrad pro kontaminovaná prostředí. K objasnění byly proto použity pouze studie přirozených mikrobiálních společenstev vystavených vlivu syntetických sloučenin v obvyklých koncentracích jejich výskytu v prostředí. Výsledky dosažené za těchto ,,přírodních" podmínek byly skutečně nesrovnatelné s laboratorními experimenty v celé řadě parametrů. Na jejich základě bylo odvozeno pět možných vysvětlení pro vznik fáze přizpůsobení mikrobiální populace danému polutantu: a) zmnožení malé populace degradujících mikroorganizmů b) přítomnost toxinů c) predace protozoi d) vznik nových genotypů e) diauxie Zmnožení malé populace degradujících mikroorganizmů Půda, přírodní vody, kaly a odpadní vody typicky obsahují malé populace mikrobiálních degradátorů, kteří mohou odbourávat syntetické organické látky nejrůznějšího chemického složení. Tyto malé populace nemohou prokazatelně degradovat kontaminující syntetické látky. Jestliže si jako příklad uvedeme populaci mikroorganizmů o koncentraci 102 buněk v jednotkovém objemu a každá z těchto buněk rozloží cca 1 pg organického substrátu, pak při aplikované koncentraci 0,1 g v jednotce tohoto objemu, nebude analytickými metodami zaznamenána žádná významná změna v koncentraci tohoto organického polutantu. Jestliže bakterie využívají látku jako zdroj uhlíku a energie, pak se malá populace degradujících buněk více či méně výrazně zmnoží. Při nízkých koncentracích substrátu je fáze přizpůsobování buněk sice velmi krátká, ale množení buněk se velmi rychle zastaví , neboť zdroj uhlíku a energie je poměrně rychle vyčerpán. Na druhé straně je patrné, že aklimatizace může být naopak velmi dlouhá, a to zejména tehdy, je-li koncentrace substrátu velmi vysoká. Bylo však zjištěno, že pro zmnožení degradujících buněk je při vysoké koncentraci substrátu vyžadován velmi dlouhý čas, a že detekovatelný úbytek substrátu může být zaznamenán teprve až po dosažení vysoké koncentrace degradujících buněk v prostředí. Je pravděpodobné, že vysoké koncentrace substrátu mohou být využívány jen malým počtem degradujících mikroorganizmů v lokalitě. K vytvoření dostatečného biodegradačního potenciálu prostředí je pak zapotřebí poměrně dlouhá doba, během které se tyto mikroorganizmy rozmnoží a umožní stanovit detekovatelný úbytek kontaminujícího substrátu. V současné době není zatím jasné, jak často dochází k takovéto aklimatizaci buněk, kterou můžeme jen předpokládat, neboť není vždy doprovázena výrazným poklesem koncentrace degradovaného substrátu. Celá řada autorů o existenci této fáze hovoří se samozřejmostí, aniž by jejich tvrzení bylo podepřeno experimentálními údaji. Bylo např. pozorováno, že při kontaminaci vody 4-nitrofenolem (2 mg/l) dochází poměrně k rychlému 14 vzrůstu počtu jeho degradátorů, ačkoliv prokazatelný úbytek látky byl pozorován až po několika dnech, kdy koncentrace buněk dosáhla cca 105 v 1 ml ( Obr.1). Dlouhá aklimatizační fáze buněk je některými autory dávána do souvislosti s toxickým působením vysokých koncentrací substrátu, čemuž ale odporuje dosažení vysoké koncentrace buněk degradátora v prostředí, která dovolí rychlý start degradace substrátu. K aklimatizaci mikroorganizmů degradujících určitý uhlíkatý substrát může dojít i po opakované kontaminaci lokality, jestliže mezi první a další kontaminací uběhla příliš dlouhá doba, která vedla k pronikavému snížení počtu degradujících buněk (substrát, predátoři, parazité). Přítomnost toxinů (toxikantů) Celá řada látek, které se dostávají do prostředí, může vykazovat toxický vliv na růst a množení mikroorganizmů. Tyto látky často kontaminují prostředí ve směsích s lehce degradovatelnými uhlíkatými látkami. Teprve až je tento toxikant z prostředí odstraněn (biodegradací, neenzymatickou destrukcí, sorpcí nebo vytěkáním), dochází k biodegradaci využitelného substrátu. Často může být substrát, který kontaminuje půdu, degradován i v přítomnosti toxikantu, jestliže je např. půda zředěna kontaminovanou zeminou bez toxikantu a nebo ve vytvořeném kalu, ve kterém dochází také k podstatnému zředění toxických kontaminujících látek. Toxikant může působit různým způsobem : Může zpomalovat růstovou rychlost degradujících druhů a prodlužovat dobu nutnou pro degradaci polutantu. Takovým toxikantem může být nejen organická látka, ale i látky anorganické (těžké kovy). Toxikant může umožnit množení některých mikroorganizmů, které jsou schopny jej využívat.V průběhu této degradace toxikantu dochází postupně ke snížení jeho koncentrace pod hladinu jeho antibakteriálního působení. V tomto období pak teprve dochází k množení ostatních degradujících mikroorganizmů uskutečňujících štěpení zbývajících polutantů. Z toho vyplývá, že k využívání zbývajících polutantů dochází až po období, které je součtem doby nutné k dosažení neinhibiční koncentrace toxikantu a doby nutné k dosažení dostatečné koncentrace degradujících buněk. Toxikant může potlačovat rychleji rostoucí druhy, které obvykle převažují mezi druhy schopnými degradovat kontaminant. U pomalu rostoucích degradátorů pak dochází jen k velmi pomalému nahromadění biomasy, která je schopna degradovat kontaminující chemikálii. Toxiny nemusí být přítomné na počátku degradace, ale dochází často k jejich hromadění v jejím průběhu. Predace protozoi Celá řada přirozených ekosystémů a vzdušněné odpadní systémy jsou charakteristické výskytem značné velké a vysoce aktivní populace protozoí.Tito mikroskopičtí živočichové se živí bakteriemi, které osidlují prostředí a výrazně snižují jejich počet. Velmi nízké koncentrace bakteriálních buněk jsou příčinou toho, že není dostatečně využíván ani lehce využitelný organický substrát. K potlačení predátorů v prostředí se často používají různé 15 selektivní inhibitory. Po použití těchto inhibitorů dochází k průkaznému zkrácení aklimatizační fáze degradujících mikroorganizmů a ke zvýšení jejich koncentrace. Eliminace protozoí v prostředí se v krátkém období projeví pozorovatelným úbytkem kontaminující látky. Vznik nových genotypů Bakterie a houby, které osidlují kontaminované prostředí, mohou často podléhat genetickým změnám, které jsou výsledkem mutací nebo přenosu genetické informace z jednoho druhu na jiný. Tyto změny se uskutečňují ve velmi nízké frekvenci a jen velmi málo buněk v populaci reprezentuje nový genotyp doprovázený fenotypovými změnami. O tom, zda se fenotypově odlišné buňky budou v kontaminovaném prostředí množit, rozhoduje celá řada faktorů, která umožní jejich selekci. Z dlouhodobých pozorování vyplývá, že ve většině kontaminovaných prostředí vznikají mutační změny mikroorganizmů spíše náhodně a nahromadění mutantů vyžaduje velmi dlouhý čas, který přesahuje předpokládanou dobu aklimatizace. Některé toxické kontaminanty se však mnohou značnou měrou podílet na vzniku a nahromadění mutantů, které umožní degradaci této nebo jiné toxické látky. Přenos genů, jejichž produkty se podílejí na biodegradaci, byl experimentálně prokázán řadou autorů. Např. schopnost degradovat chlorokatechol může být přenášena z kmene Pseudomonas na kmen Alcaligenes. Výsledkem je vznik nového genotypu, který umožňuje degradaci 2-, 3- a 4-chlorofenolu, ačkoliv tuto schopnost nemá žádný z původních kmenů. Do jaké míry se vznik těchto nových genotypů podílí na biodegradaci kontaminujících látek v přirozeném prostředí, nebylo dosud spolehlivě prokázáno. Diauxie Čisté bakteriální kultury, které se množí v prostředí obsahujícím relativně vysoké koncentrace dvou zdrojů uhlíku, nevykazují obvykle jednoduchou exponenciální fázi, která je charakteristická pro růstovou křivku buněk v prostředí s jedním zdrojem uhlíku. V prostředí se dvěma zdroji uhlíku je množení buněk charakterizováno dvěma exponenciálními fázemi, které jsou vzájemně odděleny obdobím zpomaleného nebo neprůkazného množení (Obr.3). První exponenciální fáze je charakterizována využíváním pouze jednoho substrátu, druhá fáze pak využíváním druhého substrátu.Tento dvoufázový růst mikrobiálních buněk a postupné využívání dvou substrátů je označován jako diauxie. Diauxie je v první fázi využívání uhlíkatého substrátu charakterizována potlačením syntézy enzymů pro využívání dalšího substrátu. Preferování využívání určité organické sloučeniny před jinou může být vysvětlením pro přizpůsobovací periodu v tom případě, že kontaminant je druhým substrátem. Obr.3 Dvoufázový růst bakteriální kultury v přítomnosti dvou zdrojů uhlíku C1 a C2 (Modifikováno podle Alexander,1999) Podobný diauxický růst byl pozorován při využívání sloučenin fosforu. Bylo prokázáno, že Pseudomonas testosteroni využívá přednostně anorganický fosfor před metylfosfonátem . V první fázi růstu 0 50 100 150 200 250 300 350 400 Doba kultivace Koncentracesubstrátu(ppm) 7 7,2 7,4 7,6 7,8 8 8,2 8,4 8,6 8,8 9 Logpočtubuněkv1ml C1 C2 16 a množení těchto buněk není tedy organický zdroj využíván jako zdroj fosforu a jeho degradace začíná až po využití anorganického zdroje. Přímý důkaz existence diauxie v přirozeném prostředí neexistuje. Rovněž podíl diauxie na prodlužování délky období přizpůsobování nebyl zcela prokázán. Je velmi pravděpodobné, že v komplikovaných mikrobiálních komunitách budou různé substráty využívány spíše různými mikrobiálními druhy, nežli jedním druhem s různou substrátovou preferencí. ENZYMOVÁ INDUKCE A LAG FÁZE Mikroorganizmy produkují jak konstitutivní enzymy ( i když není substrát přítomný), tak enzymy inducibilní (v přítomnosti substrátu nebo jemu strukturálně podobné látky). V prostředí bez tzv. induktoru, je koncentrace inducibilních enzymů velmi nízká. Proces indukce byl intenzivně studován a je známo, že je uskutečňován celou řadou komplexních procesů, které se podílejí na zvýšení rychlosti tvorby degradativních enzymů. Enzymatická aktivita populace může být kontrolována katabolickou represí, při které uvolňované produkty degradace jednoho substrátu potlačují syntézu enzymů souvisejících s degradací substrátu jiného, který může poskytovat tytéž produkty. Štěpení celé řady syntetických sloučenin může být indukováno. Mezi indukovatelné enzymy patří např. dehalogenázy. Přesto nelze přesně určit do jaké míry se indukce podílí na délce doby přizpůsobování, neboť indukce často proběhne velmi rychle ( minuty nebo hodiny) a fáze aklimatizace může trvat i několik týdnů. Výsledky laboratorních experimentů však naznačují, že jestliže první krok v metabolické dráze vyžaduje biosyntézu inducibilního enzymu a podmínky této indukci brání, pak sloučenina nemůže být v takovém prostředí degradována. Jednou z příčin, která brání indukci prvního enzymu metabolické dráhy, může být podprahová koncentrace induktoru v prostředí. Je např. známo, že indukce prvního enzymu v katabolické dráze 3- a 4-chlorobenzové kyseliny uskutečňované buňkami Acinetobacter calcoaceticus může probíhat jen tehdy, jestliže koncentrace těchto kontaminujících látek dosahuje alespoň 1 M. Podobně indukce amidázy, která je nutná u gramnegativních bakterií ke štěpení fenylmočovinových herbicidů, může probíhat při koncentraci 50 M, ale k indukci nedochází, jestliže koncentrace těchto herbicidů poklesla na 10M. Příčinou počátečního velmi nízkého nebo žádného poklesu kontaminující látky může být i lag fáze v růstovém cyklu degradujících bakterií. Lag fáze, která doprovází přenesení mikroorganizmů do čerstvého media, je pozorována i za laboratorních podmínek v bohatých růstových mediích. V přírodních podmínkách se na vzniku lag fáze podílí např. nízká koncentrace buněk v prostředí. Lag fáze přírodní populace zřejmě souvisí i s počáteční indukcí katabolických enzymů. V žádném případě však délka lag fáze nedosahuje délky aklimatizační periody, i když se na aklimatizaci buněk k degradaci polutantu pravděpodobně částečně podílí. MIKROBIÁLNÍ TRANSFORMACE AKTIVACE DETOXIKACE 17 BIOTRANSFORMACE Detoxikace polutantu (detoxifikace) V tomto procesu je toxikologicko aktivní látka přeměňována na neaktivní produkt. Protože toxikologická aktivita látky je spojena často s její strukturou, např. s různými typy substituentů, prostorovou konfigurací a pod., je detoxikace uskutečňována celou řadou reakcí. Detoxikace může být uskutečňována jak abioticky tak i biologicky. Biologická detoxikace uskutečňovaná mikroorganizmy je striktně závislá na koncentraci látky v prostředí. Vysoké koncentrace toxického polutantu mohou potlačovat růst mikroorganizmů a omezit detoxikaci polutantu. Ve většině případů je detoxikace uskutečňována jednoduchou primární reakcí, nejčastěji hydrolýzou, hydroxylací, dehalogenací, demetylací nebo jinou dealkylací, metylací, redukcí nitroskupiny, deaminací, štěpením éterů, přeměnou nitrilu na amid a konjugací. CO2 detoxikace mineralizace Toxická látka Inaktivní produkt Typický produkt Atypický produkt Mikroorganizmy velmi často nevyužívají toxickou látku jako zdroj uhlíku, ale jednoduchou transformací snižují její toxicitu, čímž významnou měrou přispívají k ,,ozdravení" kontaminovaného prostředí. Enzymatické reakce vedoucí k přeměně aktivní molekuly v neškodný produkt se většinou uskutečňují uvnitř buňky. Produkt pak může být buňkou likvidován jednou ze tří možností : Inaktivní produkt může být dále štěpen v řadě následných enzymatických reakcí, které vedou k tomu, že vzniká sloučenina běžně využitelná jako zdroj uhlíku a zbytek může být vylučován buňkou do prostředí jako typický produkt. Atypický produkt může být vylučován do prostředí. Inaktivní produkt může být v řadě enzymatických reakcí buňkou zcela mineralizován . Inaktivní produkt, který vzniká jednoduchou reakcí, je strukturálně velmi podobný toxinu a často jeho možná ,,toxicita" je vázána na jeho koncentraci v prostředí. Nejúčinnější detoxikační reakcí je tedy mineralizace, kdy konečným produktem je oxid uhličitý. K detoxikačním procesům, probíhajícím v kontaminovaném prostředí, bývají často řazeny i procesy kometabolické, o kterých bude pojednáno později. 18 Stručný přehled detoxikačních procesů Hydrolýza Štěpení vazby za účasti vody ( např.mikrobiální štěpení esterických vazeb v insekticidu malationu za účasti karboxyesterázy) O O || || R COR´ + H2O RCOH + HOR´ Hydroxylace: Mikrobiální adice skupiny OH na aromatickou nebo alifatickou molekulu (mikrobiální inaktivace fungicidu MBC) RH ROH Dehalogenace Celá řada pesticidů a škodlivých průmyslových zbytků obsahuje chlór nebo jiné halogeny, které způsobují toxicitu jejich molekuly.Enzymy, které se podílejí na detoxikaci těchto látek, jsou označovány jako dehalogenázy. Při dehalogenaci může být halogen nahrazen vodíkem (reduktivní dehalogenace) nebo hydroxylem (hydrolytická dehalogenace). Často může dojít k detoxikaci halogenovaných sloučenin i po odstranění halogenu a přilehlého vodíku (dehydrodehalogenace). Reduktivní dehalogenace : RCl RH Hydrolytická dehalogenace : RCl ROH Dehydrodehalogenace : RCH2CHClR´ RCH=CHR´ Demetylace nebo jiná dealkylace Celá řada pesticidů obsahuje metyl nebo jiné alkylové substituenty. Tyto mohou být vázány na dusík nebo kyslík. N- nebo O- dealkylaci katalyzují četné mikroorganizmy, přičemž dochází k výrazné detoxikaci pesticidu. Příkladem může být mikrobiální detoxikace s-triazinu, herbicidu, který je strukturálně podobný atrazinu. Půdní mikroorganizmy mohou tuto látku dealkylovat tak, že ztrácí N-etyl nebo N-izopropylovou skupinu za současné detoxikace. 19 Metylace Mikroorganizmy touto v podstatě reverzní reakcí mohou detoxikovat fenol nebo některé fungicidy. Příkladem může být detoxikace fungicidů penta- a tetrachlorfenolů, které jsou v přírodě mikrobiologicky detoxikovány O-metylací : ROH ROCH3 Redukce nitroskupiny Nitrované sloučeniny jsou toxické pro nižší i vyšší organizmy.Ke ztrátě toxicity nebo jejímu omezení může dojít v důsledku redukce nitroskupiny na aminoskupinu: RNO2 RNH2 Příkladem může být omezení toxicity 2,4-dinitrofenolu, jestliže je mikrobiologicky přeměněn na 2-amino-4- nebo 4-amino-2-nitrofenol. Podobně lze snížit toxicitu fungicidu pentachloronitrobenzenu jeho přeměnou na pentachloroanilin. Deaminace Mikrobiální deaminace, která vede k odstranění fytotoxicity, byla popsána u herbicidu metamitronu . Štěpení éterů Fenoxyherbicidy obsahují skupiny C-O-C. Štěpením těchto éterických vazeb dochází ke snížení jejich fytotoxicity. Toto mikrobiální štěpení je překvapující, neboť vazebná energie mezi uhlíkem a kyslíkem je poměrně vysoká. Přeměna nitrilu na amid 2-6-dichlorobenzonitril je potenciálním inhibitorem růstu některých rostlin (komerční preparát Dichlobenil). Mikrobiální konverzí na 2,6-dichlorobenzamid se tato látka stává inaktivní.Tato detoxikační reakce probíhá v půdě. R-CN R-CO-NH2 Konjugace Konjugace se uskutečňuje mezi různými intermediáty přirozeně probíhajících metabolických reakcí a syntetickými molekulami.Tato kombinace normálního metabolitu s toxikantem vede velmi často ke vzniku netoxické látky. Tato konjugace se může uskutečňovat jak u živočichů tak i u rostlin, ale nejvýznamnější roli při těchto detoxikačních reakcích hrají mikroorganizmy. U mikroorganizmů byly popsány: 20 glukózové konjugáty ­ houba Cunninghamella elegans konjuguje pyren s glukózou nebo může vytvářet glukózové deriváty s fenantrenem. glukuronidové konjugáty- vznikají v průběhu metabolizmu fenantrenu různými houbami glutationové konjugáty- byly pozorovány v průběhu bakteriální degradace některých herbicidů aminokyselinové konjugáty- vznikají při mikrobiální detoxikaci některých herbicidů acylové konjugáty- na acylaci se nejčastěji podílí acetyl, ale i propionylové a formylové skupiny. Acylace je uskutečňována celou řadou mikroorganizmů. Např. tvorba acetylovaných aromatických aminů byla popsána při mikrobiální degradaci trinitrotoluenu (TNT). sulfonátové a sulfátové konjugáty - vznikají např. při štěpení fenantrenu a 2- nitrofluorenu houbami konjugáty dikarbonových kyselin- tyto produkty (benzyljantarová kyselina a benzylfumarová kyselina) byly pozorovány při anaerobní transformaci toluenu. K mikrobiální detoxikaci různých substrátů může tedy docházet nejrůznějším způsobem. Mechanizmy detoxikace nejsou závislé jen na struktuře toxikantu, ale i na přítomných enzymech.Vzhledem k tomu, že většina mikrobiálních produktů degradace nebyla dosud chemicky popsána a dokonale toxikologicky prozkoumána, lze říci, že v průběhu mikrobiálního využívání a transformace může docházet nejen ke snížení toxicity původního substrátu, ale i naopak, že v některých případech mohou vznikat produkty toxičtější než původní substrát. Aktivace netoxického polutantu Během mikrobiální transformace může dojít k nežádoucím přeměnám slabě toxických či netoxických kontaminujících látek v látky silně toxické, které ohrožují zdraví člověka, zvířat a rostlin. Často vznikají i látky, které jsou toxické pro samotné mikroorganizmy, takže výsledkem je jejich akumulace a perzistence v prostředí. Lze tedy říci, že samotná kontaminující látka není tak problematická pro životní prostředí jako její transformační produkt. Tento proces vzniku toxických produktů z neškodných substrátů je znám pod pojmem aktivace. Aktivace polutantů probíhá v půdě, vodě, splaškových vodách a všude tam, kde je prostředí osídleno mikroorganizmy. Vznikající toxické produkty mohou být produktem kometabolizmu (viz dále), ale i meziprodukty vznikajícími v průběhu procesu mineralizace. karcinogen aktivace mutagen rychlá mineralizace NETOXICKÁ LÁTKA teratogen akutní toxikant pomalá mineralizace fytotoxin antimikrobiál.látka perzistence 21 Významné mechanizmy aktivace Dehalogenace : Cl2C=CHCl ClHC=CH2 trichloretylen vinyl chlorid (karcinogen) Halogenace Houby, řasy a bakterie jsou často vybaveny enzymy, které katalyzují adici chloridu nebo bromidu do organických molekul. Většina těchto reakcí je velmi dobře prostudována, jsou známy enzymy i vznikající produkty. Např. některé řasy mohou vytvářet trichloretylen nebo tetrachloretylen (PCE). Byly popsány i řasy, které uvolňují chloroform, bromoform a jiné halogenované deriváty metanu. V přirozených procesech rovněž vzniká kyselina trichloroctová. Chlorované aromatické sloučeniny mohou být izolovány z lesní půdy a z některých rostlinných materiálů. Bazidiomycety produkují organohalogeny. Řada těchto látek je toxická a perzistuje v prostředí. Tvorba nitrózaminů ze sekundárních aminů a nitrátů. Aminy a nitráty najdeme ve většině půd a přírodních vodních zdrojů. Nitráty jsou chemikálie, kterých je ročně vyráběno miliony kilogramů. Sekundární aminy jsou přítomné v živočišném i rostlinném materiálu, vznikají v rozkladných procesech. K nitrózaci sekundárních aminů dochází v přítomnosti nitritů, které vznikají mikrobiologickou přeměnou nitrátů. Produktem jsou nitrózaminy (karcinogeny, teratogeny,mutageny): R N ­ N = O R´ Ve většině případů jsou R a R´identické. Tyto látky jsou velmi aktivní i ve velmi nízkých koncentracích. V průmyslu je rovněž využívána celá řada sekundárních a terciárních aminů. Terciární aminy mají tuto strukturu : R N ­ R´´ R´ Sekundární a terciární aminy jsou obvykle přítomné v celé řadě domácích produktů a rovněž řada pesticidů je tvořena sekundárními a terciárními aminy nebo jsou některé na terciární aminy transformovány v půdě. Široký výskyt těchto látek byl zaznamenán jak v povrchových vodách, tak i ve vodách odpadních, v kalech a v půdě. Terciární aminy jsou v přírodě často transformovány mikrobiologickou cestou na sekundární aminy.Transformace je znázorněna v následující rovnici : R R N ­ R´´ NH R´ R´ 22 Často bývá studována mikrobiální transformace trimetylaminu na metylamin : (CH3)3N (CH3)2NH Sekundární aminy mohou být aktivovány N-nitrózací za vzniku vysoce toxických N-nitrózosloučenin : R R NH + NO2 - N ­ N = O + OH- R´ R´ Tato nitrózace se může uskutečňovat ve vodách i v půdě a jako prekurzory mohou sloužit např. dimetylamin a dietylamin. Nitrózační reakce mohou probíhat i spontánně, zejména při nízkých hodnotách pH prostředí. Epoxidace Mikroorganizmy velmi často tvoří epoxidy z látek nesoucích dvojnou vazbu : - HC = CH - -HC - CH- epoxid O Touto cestou bývají mikrobiologicky oxidovány některé insekticidy, přičemž vznikající produkt je toxický pro živočichy. Příkladem může být transformace heptachlóru na heptachlórepoxid, která probíhá v půdě. Podobně může být oxidován aldrin (insekticid) na jeho epoxid označovaný jako dieldrin. Dieldrin se stal v přírodě enormně problematickým, neboť je nejen toxičtější ve srovnání s aldrinem, ale dlouhodobě perzistuje (více než 15 let) a ohrožuje ložiska podzemních vod. Přeměna organických fosfonotionátů na organické fosfonáty S O RO || RO || P OX P OX RO RO Velká skupina používaných insekticidů jsou fosfonotionáty. Radikál R je obvykle tvořen krátkým alkylovým řetězcem, typické jsou CH3- nebo CH3CH2- radikály. Radikál, který je označen v rovnici symbolem X, může mít velmi proměnlivou chemickou strukturu. Fosfonotionáty mají jen nízkou toxicitu, ale jejich přeměnou na fosfonát vzniká vysoce toxická látka pro člověka a jiné savce (inhibitory cholinesterázové aktivity). Tato přeměna může být uskutečňována mikroorganizmy v přirozených i zemědělských lokalitách. Podobným typem aktivace může být transformace fosfonoditionátů, kdy vazba P=S je transformována na P=O. Tato přeměna byla pozorována v půdě. 23 Oxidace tioéterů Některé látky obsahující tioéterové vazby (-C-S-C-) jsou používány jako insekticidy (např. aldicarb-nematicid) a vykazují toxicitu pouze pro hmyz. V přírodě mohou být tyto látky transformovány a současně aktivovány za vzniku sulfoxidů a sulfonů : O O || || - C ­ S ­ C - -C- S ­ C - - C ­ S ­ C ­O || O Tyto reakce mohou probíhat v půdě a jsou uskutečňovány mikroorganizmy. Hydrolýza esterů Některé herbicidy jsou aktivovány hydrolýzou za vzniku fytotoxinu, který je tvořen kyselinou O O || || RCOR´ RCOH Radikálem může být metyl, etyl. Dalším možným produktem přeměny je netoxický alkohol HOR´. V přírodě zřejmě existuje celá řada dalších možných transformací látek vedoucích k tvorbě vysoce toxických produktů.Toxické produkty, často neznámého složení, ohrožují spodní vody a stávají se nebezpečím pro zdraví obyvatel na naší planetě. Různé typy transformací byly prokázány v laboratorních podmínkách za využití čistých mikrobiálních kultur. Všeobecně bylo prokázáno, že většina aktivovaných látek perzistuje v přírodě, mění se jejich mobilita a vyskytuje se často ve velkých vzdálenostech od místa původní kontaminace. Všechny látky, které mohou být v přírodě aktivovány, vytvářejí chemickou časovanou bombu. Nebezpečí ,,výbuchu" této bomby snižuje syntéza a použití takových látek, které jsou přírodními společenstvy aktivovány jen velmi pomalu, ale naopak jsou rychle pozměny tak, že nemůže dojít k následné aktivaci : aktivace Pomalá reakce B(toxická) A (netoxická) Rychlá reakce defusing C1 (netoxická) Nelze aktivovat C2 (netoxická) Příkladem rychlé reakce, která zabraňuje aktivaci molekuly, může být rozklad molekuly na dvě neaktivovatelné složky (defusing). RIZIKA BIODEGRADACE V každém prostředí vznikají více či méně toxické produkty mikrobiálního rozkladu nejrůznějších polutantů. Je tedy zřejmé, že biodegradace látek kontaminujících životní prostředí není bez rizik. Ovšem každá technologie má svoje rizika. Tato rizika mohou být 24 značná nebo jen malá, ale vždy existují. Našim úkolem je poznání faktorů, které riziko biodegradace snižují nebo zcela redukují. Úkolem chemiků je syntéza takových látek, které vedle cílených účinků jsou v přírodě rozložitelné na netoxické produkty. Úkolem mikrobiologů je poznat co nejlépe širokou škálu metabolických reakcí a enzymů, které se podílejí na rozkladu látek vnášených do životního prostředí. Společným cílem obyvatel naší planety Země musí být její cílené ozdravení a zachování pro další generace. KINETIKA BIODEGRADACE Poznatky o kinetice biodegradace jsou velmi důležité pro stanovení perzistence nebo rychlosti rozkladu organického polutantu a pro odvození doby, po kterou bude tento polutant ovlivňovat životní prostředí. Nejčastěji je sledován úbytek původní kontaminující látky. To je ovšem možné jen v tom případě, kdy tato látka je již v prvním kroku detoxikována a v další metabolické sekvenci nejsou akumulovány žádné intermediáty. Tato metoda tedy nemůže být použity pro polutanty, které jsou metabolizovány jen částečně a intermediáty biodegradace se hromadí v prostředí a dokonce jsou značně toxické. Byla navržena celá řada modelů pro sledování průběhu biodegradace polutantů různými mikroorganizmy. Nejčastěji jsou to modely, které vycházejí z procesů uskutečňovaných rostoucími buňkami. Existují také modely pro biodegradaci uskutečňovanou nerostoucími buňkami, které jsou aplikovaný ve vysoké koncentraci do prostředí a simulují spíše enzymatické reakce podílející se na biodegradaci. Rychlost transformace či mineralizace polutantu je pak sledována především v závislosti na koncentraci kontaminující organické látky, ale i na hodnotě pH prostředí, půdní vlhkosti a teplotě nebo přítomnosti fertilizátorů klíčových reakcí. Nevýhodou modelových studií je využití jednotlivých mikrobiálních izolátů nebo sledování dílčích enzymových reakcí. Jsou tedy vzdálené od biodegradací probíhajících v přirozených podmínkách, kde jsou degradátoři vystaveni predátorům, parazitům a ostatním složkám mikrobiálního společenstva, které mohou podstatně ovlivnit průběh i výsledek biodegradace. Je tedy jen velmi málo pravděpodobné, že by jednoduchý degradační model nebo rovnice mohly být využitelné k prognóze rychlosti biodegradace všech organických polutantů v různých přirozených prostředích. Mikroorganizmy mohou uskutečňovat biodegradaci jednoduchých organických substrátů , jestliže a) rostou na kontaminujícím substrátu, který využívají jako zdroj uhlíku a energie (nebo jako zdroj jiného prvku nutného pro množení), b) rostou na jiném substrátu, který využívají jako zdroj uhlíku a energie a metabolizují kontaminující substrát, c) nerostou, ale metabolizují kontaminující substrát. Procesy vázané na růst buněk Všechny experimenty, ze kterých byly odvozeny jednotlivé modely pro průběh degradace polutantů, pracují s populacemi buněk jednoho bakteriálního druhu a jako zdroj uhlíku využívají jednoduché organické látky. Pro zjednodušení vysvětlení tyto modely vycházejí z netoxických látek rozpustných ve vodě , přičemž bakteriální buňky mají v těchto systémech zajištěny ostatní optimální podmínky pro růst (aerace, anorganické látky, růstové faktory, atd.). Při nízkých koncentracích zdroje uhlíku a energie je růstová rychlost organizmů velmi nízká, protože je limitována nízkou koncentrací uhlíkatého substrátu. Se vzrůstající koncentrací uhlíkatého substrátu růstová rychlost buněk proporcionálně vzrůstá až 25 k dosažení maxima. Po dosažení maxima je další zvyšování koncentrace substrátu bezvýznamné.Tento vztah definoval matematicky Monod (1949): = max S/ Ks + S kde specifická růstová rychlost studovaného mikroorganizmu, max maximální specifická rychlost (je dosažena při vysoké substrátové koncentraci) S koncentrace substrátu Ks konstanta, která představuje koncentraci substrátu, při které je růst buněk uskutečňován s poloviční rychlostí dosažitelného maxima Grafickým vyjádřením Monodovy rovnice je hyperbola. Hodnoty Ks vyjadřují afinitu organizmu k růstovému organickému substrátu. Nízké hodnoty Ks vyjadřují tedy vysokou afinitu organizmu k substrátu a opačně, vysoké hodnoty velmi nízkou afinitu k substrátu. Pro jeden bakteriální kmen se hodnoty substrátové konstanty Ks liší v závislosti na substrátu. Obráceně, hodnoty Ks pro jednotlivé substráty se liší v závislosti na mikroorganizmu. V Tabulce 1 jsou uvedeny často i dvě hodnoty Ks pro jediný substrát. První hodnota uvádí afinitu čisté bakteriální kultury k danému substrátu, druhá pak afinitu v mikrobiální komunitě. Hodnoty Ks pro čisté kultury mohou být značně nízké,( tj.buňky mají vysokou afinitu k substrátu) a pohybují se kolem 20 g/l. Jiné hodnoty Ks se pohybují v koncentracích často výrazně vyšších než 1 mg/l a můžeme říct, že tyto buňky či komunity mají nízkou afinitu k růstovému substrátu. Tabulka 1 Hodnoty Ks pro bakterie rostoucí ve vodním prostředí (Alexander,1999) Substrát Organizmus nebo vzorek Ks (mg/l) Reference ________________________________________________________________________ Glukóza Flavobacterium 1 0,0071 van der Kooij and Hijnen (1981) Flavobacterium 2 29, 1314 Ishida et al.(1982) Říční voda 26 Larson (1980) Glutamát Aeromonas sp. 0,163, 1,3 Ishida et al. (1982) Maltóza Butyrivibrio fibrosolvens 2,1 Russell and Bladwin (1979) Xylóza Butyrivibrio fibrosolvens 55 Russell and Bladwin (1979) m-krezol vzorek vody 0,0006-0,0018 Bartholomew and Pfaender (1983) Chlorobenzen vzorek vody 0,0010-0,0051 Bartholomew and Pfaender (1983) NTA vzorek vody 0,060-0,170 Bartholomew and Pfaender (1983) Fenol odpadní voda 1,3-270 Rozich et al. (1985) V přirozených systémech bylo pro jeden substrát detekováno více hodnot Ks. Např. v testech s jezerní vodou bylo zjištěno, že přítomné mikroorganizmy degradující fenol rostou poloviční max (0,5 max) v různých koncentracích fenolu, tedy při různých hodnotách Ks. Tyto odlišné hodnoty Ks charakterizují jednak afinitu degradujícího 26 společenstva k fenolu, jednak afinitu jednotlivých degradátorů k tomuto uhlíkatému růstovému substrátu. Je tedy zřejmé, že Monodova kinetika nemůže být zevšeobecněna pro všechny degradující systémy. Její využití se zdá nevhodné zejména pro stanovení růstu mikroorganizmů a jejich afinity k nerozpustným substrátům nebo k substrátům s vysokou toxicitou. Jestliže budeme uvažovat, že každá buňka v exponenciální růstové fázi metabolizuje stejný objem uhlíkatého substrátu, pak bychom měli po logaritmování hodnot zaznamenat lineární pokles koncentrace substrátu v čase.Ve skutečnosti však při záznamu změn koncentrace substrátu v čase získáme křivku, která je charakterizována počátečním malým poklesem koncentrace substrátu. Tento malý pokles koncentrace substrátu můžeme zdůvodnit nízkou koncentrací bakteriálních buněk na počátku exponenciální fáze růstu.Se vzrůstem počtu buněk v průběhu střední exponenciální fáze jejich množení dochází k velmi rychlému poklesu koncentrace sledovaného organického substrátu.V závěru exponenciální fáze růstu buněk degradátora však již není pozorováno žádné nebo jen velmi malé snížení koncentrace organického substrátu. Pokles koncentrace substrátu se tedy vztahuje jen na několik málo dělení buněk v průběhu jejich exponenciálního množení. Logaritmická kinetika poklesu koncentrace může být vyjádřena vztahem : dS/dt = max (S0 + X0 ­ S) kde S0 je počáteční koncentrace substrátu S je koncentrace substrátu v čase t X0 je množství substrátu, které je nutné pro vytvoření počáteční populace Pokles koncentrace substrátu podle logaritmické kinetiky probíhá za předpokladu, že S0 >> Ks. Jestliže je S0 << Ks, pak se růstová rychlost buněk snižuje s postupným snižováním koncentrace substrátu. Příkladem této situace může být množení buněk Escherichia coli v médiu s nízkou koncentrací glukózy. Buňky se v tomto prostředí začínají množit a současně využívají glukózu, jejíž koncentrace rychle klesá. Tento pokles způsobuje snížení rychlosti dělení buněk a prodloužení intervalu mezi každým dělením. Tedy na rozdíl od klasické exponenciální fáze růstu, ve které je doba nutná k rozdělení buněk konstantní, je růst v mediu s koncentrací substrátu nižší než Ks charakterizován prodlužováním generační doby, i když počet buněk plynule stoupá. Tento růst zajišťuje logistickou kinetiku degradace substrátu. Nízká koncentrace substrátu může zajistit množení jen malé populace buněk. Pro zajištění průběhu degradace substrátu podle logistické kinetiky je tedy nutná nejen nízká koncentrace substrátu, ale i velmi malý počet buněk využívajících tento substrát. Logistickou kinetiku můžeme zaznamenat rovnici: -dS/dt = dS (S0 + X0 ­ S) Křivka logistické kinetiky může být někdy transformována do přímky, a to v rozmezí období, kdy se počet buněk zvyšuje z 10 na 90% dosažitelného maxima koncentrace buněk. V prostředí, ve kterém koncentrace substrátu odpovídá přibližně hodnotě Ks ( S0 s), nelze aplikovat ani logaritmickou ani logistickou kinetiku. Situace je v tomto případě velmi složitá, neboť specifická růstová rychlost není přímo závislá na koncentraci substrátu, jak je tomu v případě S0<>Ks. Substrát je v tomto případě využíván podle tzv. Monod-with-growth kinetiky. Tato kinetika může být vyjádřena matematicky vztahem : 27 -dS/dt = max S(S0 + X0 ­ S) / Ks + S Již dříve jsme si řekli, že vysoké koncentrace celé řady kontaminujících látek jsou pro mikroorganizmy toxické, i když tyto mikroorganizmy mohou tyto látky využívat jako zdroj uhlíku. Pro tyto chemikálie existuje typický vztah mezi růstem bakteriálních buněk a koncentrací zdroje uhlíku. U těchto látek lze pozorovat, že růstová rychlost buněk vzrůstá současně se zvyšováním koncentrace substrátu v tzv. nízké koncentraci. Při dosažení určité kritické koncentrace tohoto substrátu je však zaznamenán náhlý pokles růstové rychlosti buněk, který se dále prohlubuje s dalším zvyšováním koncentrace sledované látky. Běžně využívaná látka má tedy od určité koncentrace účinek antibakteriální. Vztah mezi růstovou rychlostí a koncentrací takového potenciálně toxického organického substrátu (živiny) charakterizuje Haldanova modifikace Monodovy rovnice : = max S / Ks + S + (S2 / K1) K1 je inhibiční konstanta, která charakterizuje potlačení růstu buněk toxickým substrátem Tato rovnice byla sestavena na základě studia kinetiky degradace fenolu a pentachlorofenolu Biodegradace nerostoucími mikroorganizmy Z předchozí kapitoly vyplynulo,že pokud se bakterie mají množit, musí být koncentrace substrátu natolik vysoká, aby bylo dosaženo zvýšení počtu buněk degradátora, který bude substrát využívat.V dalších experimentech bylo však pozorováno, že při velmi vysoké koncentraci degradujících buněk v prostředí vzhledem k relativně nízké koncentraci substrátu nedochází sice k množení buněk, ale substrát je přesto degradován. Za těchto podmínek můžeme opět uvažovat tři různé situace, které mohou nastat ve vztahu koncentrace substrátu a afinity buněk : S0>> Ks, S0 Ks a S0 << Ks. Ve všech těchto případech nedochází k množení buněk a kinetika degradace spíše odpovídá kinetice enzymových reakcí. Vztah mezi rychlostí enzymové reakce a koncentrací substrátu je často nejvhodnější vyjádřit rovnicí podle Michaelis-Mentenové : = Vmax S / Km + S je reakční rychlost V max je maximální reakční rychlost Km je Michaelisova konstanta Tato rovnice vyjadřuje podobný vztah jako Monodova rovnice s tím rozdílem, že , max a Ks je nahrazeno ,Vmax a Km. Základní rozdíl však spočívá v tom, že podle kinetiky Michaelis-Mentenové je koncentrace reaktivního materiálu-enzymu konstantní, zatímco u Monodovy kinetiky koncentrace reaktivního materiálu-buněk stoupá v důsledku jejich dělení.Vzhledem k tomu, že kinetika podle Michelis-Mentenové je založena na konstantní koncentraci reaktivního materiálu, lze ji využít pro charakteristiku systému s nerostoucími buňkami. 28 V případě, že S0 >>Km , je počáteční pokles substrátu v důsledku transformace nerostoucími buňkami téměř neznatelný.Rychlost degradace je však konstantní (kinetika nultého řádu) až k dosažení koncentrace substrátu odpovídající hodnotě Km (Monod-no- growth kinetika). Při S0<> Ks ( nebo S0>> Km), kdy se buňky nemnoží ,ale i v případě, že mikroorganizmy rostou podle logistické kinetiky při S0