Jméno:

   Datum:

   

   Téma: Přímá somatická embryogeneze z květních lůžek a listů cinerárie (popelivky) (Senecio  x
   hybridus  Hyl.).

   

   Materiál: uzavřená poupata a listové čepele cinerárie

   

   Média:

   Murashige nad Skoog (1962) makro a mikroelementy (MS) s přídavkem: 0,55 mM (1 g.l^-1)
   myoinositol, 2,9 μM (5 mg.l^-1) thiamin-HCl, 13,5 μM (3 mg.l^-1)
   2,4-dichlofenoxyoctová kyselina (2,4-D), μM 4,5 (1 mg.l^-1) benzyladenin, 88 mM (30
   g.l^-1) sacharosa, 8g.l^-1 agar.

   Schenk and Hildebrandt (1972) makro a mikroelementy (SH) se stejnými doplňky jako MS.

   

   Povrchová desinfekce a příprava explantátu.

   

   Postup:

   1. Lůžka květenství (úborů)

   1.             Úbory s uzavřenými poupaty s 2 cm stonkem se ponoří do 70% etanolu a ožehnou
   rychlým protažením plamenem kahanu.

   2.             Následuje desinfekce v roztoku 20% SAVO + 0,1% Triton X-100 po dobu 10 min. a
   trojí máchání ve sterilní destilované vodě.

   3.             Asepticky se odstraní lístky zákrovu a všechny květy a lůžko úboru se rozřízne
   vertikálně na poloviny.

   4.             (Při silné kontaminaci poupat se doporučuje použít opakovanou desinfekci
   (květní lůžko se znovu ponoří do 10% roztoku SAVO na 5 min a 3x máchá ve sterilní destilované
   vodě).

   5.             První explantát se položí na MS medium a označí A, druhý explantát na médium SH
   a označí B, pořadovým číslem se pak značí jednotlivé úbory.

   

   2. Listové čepele

   Listové čepele prvních pravých listů asepticky vypěstovaných klíčních rostlin a nebo čepele
   cinerárie kultivované v in vitro podmínkách se rozříznou na dvě stejné poloviny.

   První explantát se položí na MS medium a označí A, druhý explantát na médium SH a označí B,
   pořadovým číslem pak jednotlivé listy.

   

   Pokus 1.         Vliv základního média na iniciaci somatických embryí.

   

   medium:       Petriho misky s SH médiem + 13,5 μM 2,4-D + 4,5 μM BA

   Petriho misky s MS médiem + 13,5 μM 2,4-D + 4,5 μM BA

   Postup:

    1. Povrchově sterilizuj explantáty tak, jak je popsáno výše.
    2. Rozřízni lůžka úborů nebo listové čepele na identické poloviny a polož první polovinu na
       SH médium a označ An (n = 1 – x), druhou na MS médium a označ Bn (n = 1 – x).
    3. Kultivuj kultury ve tmě při teplotě 22 - 25°C.
    4. Týdně kontroluj průběh kultivace, vyřazuj kontaminované kultury.
    5. Po 2 a 4 týdnech vyhodnoť četnost somatické embryogeneze a zapiš do protokolu.

   

   Předpokládané výsledky:

   Od 2. týdne kultivace se na explantátech kultivovaných na SH médiu vytváří bílý krystalický
   kalus a zřídka somatické embryo. Na explantátech kultivovaných na MS médiu se vytváří shluky
   žlutých globulárních embryí.

   Ve 4. – 5. týdnu kultivace na SH médiu se na listových čepelích rozrůstá bílý kalus, květní
   lůžka jsou zduřelá, bez somatických embryí. Explantáty kultivované na MS médiu jsou pokryty
   žlutými-žlutozelenými somatickými embryi v globulárním až srdčitém vývojovém stadiu.

   

           Pokus 2.         Dozrávání (maturace) somatických embryí a regenerace rostlin

   

   Iniciace a vývoj somatických embryí jsou často ovlivněny výživou a růstovými regulátory.
   Složení indukčních, udržovacích, maturačních a zakořeňovacích médií se často liší. Např.
   iniciační média obsahují vysoké koncentrace auxinů a nebo auxinům podobných komponent. Naproti
   tomu maturační média neobsahují růstové regulátory nebo jen jejich velmi nízké koncentrace.
   Zakořeňovací média mají často redukovanou koncentraci základních solí a cukru.

   

   Materiál:   Petri misky s MS médiem + 0,5% aktivní uhlí

   Petri misky s MS médiem bez růstových regulátorů

   kultivační nádoby Magenta s MS médiem bez růstových regulátorů

   rašelinová multiplata, rašelinový substrát, mikrotenové sáčky

   

   Postup:

   1.             Založ experiment, jak je popsáno výše.

   2.             Přenes explantáty označené písmenem A na MS medium obsahující aktivní uhlí a
   označ jako variantu C, po 3 dnech kultivace je přenes na MS medium bez růstových regulátorů.

   3.             Paralelně s bodem 2. přenes další explantáty označené písmenem A na čerstvé MS
   médium bez růstových regulátorů a označ jako variantu D.

   4.             Kultivuj všechny kultury za stejných podmínek popsaných výše. Rozděl somatická
   embrya podle kategorií (globulární, srdčitá, kotyledonární), spočítej a zapiš do protokolu.

   5.             Odděl kotyledonární embrya od explantátu a přenes do MS média bez růstových
   regulátorů v nádobách Magenta. Kultivuj na světle (25 – 75 μmol.m^-2.s^-1) ve 22°C.

   6.             Rostliny 2 cm vysoké přenes do skleníku do vlhkého rašelinového substrátu a
   překryj mikrotenovým sáčkem (nebo vlož do mikropařeniště).

   7.             Po 2 – 3 týdnech aklimatizace (postupné větrání rostlin) přesaď rostliny do
   květináčů a dále pěstuj podle požadavků kultury.

   

   Předpokládané výsledky:

   Somatická embrya varianty A se vytváří přímo na explantátu a nerovnoměrně se vyvíjejí –
   pozorujeme všechna vývojová stádia. Asi 1/3 kotyledonárnách embryí přenesená na MS médium
   s aktivním uhlím vytvoří kořínky a prýty v průběhu 10 dní, ostatní přenášená přímo na M-S bez
   růstových regulátorů vytvoří pouze kořínek a nebo neklíčí.

   Většina rostlinek cinerárie odvozených ze somatických embryí se lehce aklimatizuje. Květy jsou
   sice menší, ale normálně tvarované a vybarvené.

   

   Literatura:     Trigiano