Kryoprezervace

   

   Je neletální skladování pletiv při ultranízkých teplotách. Využívá se pro minimalizace růstu a
   vývoje in vitro, uchování životaschopnosti a genetické stability šlechtitelských materiálů,
   zachování plného vývojového a funkčního potenciálu i pro šetření pracnosti manipulací. Jednou
   z používaných metod je kryoprezervace s použitím enkapsulace a dehydratace (Benson 1993).
   K enkapsulaci se používá alginát sodný.

   Lze enkapsulovat izolované meristémy, kalusy, suspenzní kultury apod.

   

   Obecný postup při enkapsulaci/dehydrataci (Benson 1993)

   

    1. Kultura prýtů



    2. Aklimatizace kultury




    3. Izolace meristémů



    4. Přenos do 3% alginátu



    5. Nasátí alginátu s meristémy do pipety



    6. Kapání kapek do roztoku s CA^2+ ionty



    7. Polymerace alginátu (enkapsulace)




    8. Přenos do roztoku sacharózy (dehydratace, 1-5 dní)



    9. Vysušení v proudu vzduchu (laminární box, 1-4 hod)



   10. Rychlé zmrazení v tekutém dusíku (-196 °C)



   11. Rozmrazení



   12. Testování životaschopnosti

   Úkol:  Testování vlivu izolace a enkapsulace na životaschopnost meristémů Solanum tuberosum

   

   Při používání metody kryoprezervace je nutno pro každý rostlinný materiál otestovat jednotlivé
   kroky, aby bylo jisté, zda některý z nich nezpůsobuje ztrátu životaschopnosti materiálu.

   

   Materiál:

   Kultura prýtů Solanum tuberosum, 3% alginát sodný v médiu bez CA^2+ iontů, 0,1M CaCl[2],
   Petriho misky s navlhčeným filtračním papírem, skalpel a pinzeta, kahan, laminární box,
   automatická pipeta, sterilní modré špičky se seříznutou špičkou

   

   Postup:

   (body 3. – 7. z výše uvedeného pracovního schématu)

    1. Z prýtů sterilní kultury Solanum tuberosum izolujte na navlhčeném filtračním papíru
       s použitím preparačního mikroskopu apikální a axilární meristémy.
    2. Izolované meristémy vložte do roztoku alginátu sodného.
    3. Pipetou se  seříznutou modrou špičkou nasajte alginát s meristémy.
    4. Kolmo postavenou pipetou pomalu odkapávejte alginát do roztoku CaCl[2], tak aby se
       vytvářely kapky s centrálně umístěným meristémem.
    5. Ponechte 30 minut polymerizovat.
    6. Vytvořené kuličky alginátu obalující meristém přeneste na povrch M-S media.

   

   Hodnocení

   V následujících týdnech vyhodnoťte růst meristému.

   

   Literatura:

     o Benson E. E. Cryopreservation. – In: Dixon R.A. et Gonzales R.A. (Eds.):  Plant Cell
       Culture: A Practical Approach. - ILR Press, Oxford University Press, 1993.
     o Kováč J. (1995): The use of in vitro methods for plant genetic conservation (využití
       kultur in vitro k uchování genových zdrojů rostlin). – Zahradnictví, 22: 143 – 148.