Drosophila melanogaster Základní informace Historie Morgan, Bridges, Sturtevant, Muller, Rubin, Spradling, Garcia-Bellido, Ashburner V současnosti pracuje na problematice 6 490 vědců Výhody pro genetiku 4 páry chromozomů krátký generační cyklus a velké množství potomků existence polytenních chromozomů snadná laboratorní manipulace Hlavní databázové adresy Fly Base - A Database of the Drosophila Genome http://flybase.bio.indiana.edu/ Berkeley Drosophila Genome Project (BDGP) http://www.fruitfly.org/ European Drosophila Genome Project (EDGP) http://edgp.ebi.ac.uk/ Databázové informace Bibliografie, více než 156 tis. citací Popsáno více než 46 tis. alel, 14 tis. aberací, 9 tis. transkriptů Známo celkem 14 480 kmenů drozofil Chromozomy u Drosophila melanogaster Chromozom X akrocentrický Chromozom Y asi 0,79 délky X geny kódující organizátor jadérka (bobbed - ňouma, netrefený) geny působící při primární spermatogenezi (kl 1 ­ kl 5) Chromozomy 2. a 3. metacentrické Chromozom 4. je velice malý Genom Drosophila melanogaster Ramena 4 chromozomů dělena na 102 sektorů Genom Drosophila melanogaster Obsah DNA v diploidní buňce 0,35-0,36 pg 74% genomu tvoří nerepetitivní DNA 24% genomu tvoří repetitivní DNA 12% vysoce repetitivní s nejčastějším motivem ATAAT, ATATAAT, AATAACATAG, AAGAG, AGAGAAGAAG 99% známých mutací leží v euchrochomatinových oblastech Charakteristická je nízká nebo žádná metylace cytosinu Genom Drosophila melanogaster 69% euchromatin 31% heterochromatin Genom Drosophila melanogaster Genom kompletně zmapovám Počet genů je 13 615 odhad z proužků na polytenních chromozomech byl asi 5 000, některé proužky obsahují více než jednu komplementační skupinu, až 15 000 genů minimální počet genů mnohobuněčných organizmů se odhadoval na 12-14 000 genů Velikost haploidního genomu je asi 180 Mb (124 Mb eu-, 56 Mb heterochromatin) Science 2000, 287, 2185-95 The genomic sequence of D. melanogaster Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans CA, Gocayne JD, Amanatides PG, Scherer SE, Li PW, Hoskins RA, Galle RF, George RA, Lewis SE, Richards S, Ashburner M, Henderson SN, Sutton GG, Wortman JR, Yandell MD, Zhang Q, Chen LX, Brandon RC, Rogers YH, Blazej RG, Champe M, Pfeiffer BD, Wan KH, Doyle C, Baxter EG, Helt G, Nelson CR, Gabor GL, Abril JF, Agbayani A, An HJ, Andrews-Pfannkoch C, Baldwin D, Ballew RM, Basu A, Baxendale J, Bayraktaroglu L, Beasley EM, Beeson KY, Benos PV, Berman BP, Bhandari D, Bolshakov S, Borkova D, Botchan MR, Bouck J, Brokstein P, Brottier P, Burtis KC, Busam DA, Butler H, Cadieu E, Center A, Chandra I, Cherry JM, Cawley S, Dahlke C, Davenport LB, Davies P, de Pablos B, Delcher A, Deng Z, Mays AD, Dew I, Dietz SM, Dodson K, Doup LE, Downes M, Dugan-Rocha S, Dunkov BC, Dunn P, Durbin KJ, Evangelista CC, Ferraz C, Ferriera S, Fleischmann W, Fosler C, Gabrielian AE, Garg NS, Gelbart WM, Glasser K, Glodek A, Gong F, Gorrell JH, Gu Z, Guan P, Harris M, Harris NL, Harvey D, Heiman TJ, Hernandez JR, Houck J, Hostin D, Houston KA, Howland TJ, Wei MH, Ibegwam C, Jalali M, Kalush F, Karpen GH, Ke Z, Kennison JA, Ketchum KA, Kimmel BE, Kodira CD, Kraft C, Kravitz S, Kulp D, Lai Z, Lasko P, Lei Y, Levitsky AA, Li J, Li Z, Liang Y, Lin X, Liu X, Mattei B, McIntosh TC, McLeod MP, McPherson D, Merkulov G, Milshina NV, Mobarry C, Morris J, Moshrefi A, Mount SM, Moy M, Murphy B, Murphy L, Muzny DM, Nelson DL, Nelson DR, Nelson KA, Nixon K, Nusskern DR, Pacleb JM, Palazzolo M, Pittman GS, Pan S, Pollard J, Puri V, Reese MG, Reinert K, Remington K, Saunders RD, Scheeler F, Shen H, Shue BC, Siden-Kiamos I, Simpson M, Skupski MP, Smith T, Spier E, Spradling AC, Stapleton M, Strong R, Sun E, Svirskas R, Tector C, Turner R, Venter E, Wang AH, Wang X, Wang ZY, Wassarman DA, Weinstock GM, Weissenbach J, Williams SM, WoodageT, Worley KC, Wu D, Yang S, Yao QA, Ye J, Yeh RF, Zaveri JS, Zhan M, Zhang G, Zhao Q, Zheng L, Zheng XH, Zhong FN, Zhong W, Zhou X, Zhu S, Zhu X, Smith HO, Gibbs RA, Myers EW, Rubin GM, Venter JC. Celera Genomics, Rockville, USA Postup mapování genomu 9216 kontigů, naštěpení Hinf1 1085 YAC RT-PCR Polytenní chromozomy Analýza informací DNA Známé genetické mechanizmy Polytenní chromozomy Hybridní dysgeneze Kompenzace dávky genů u samečků dochází ke dvojnásobné transkripci X chromozomu (dominantní gen Sex-lethal) U samečků nedochází k rekombinaci Variabilita genomu standardních linií kolísá mezi 0,002-0,018 dva náhodně vybrané chromozomy se liší v průměru ve 4 bp na 1 kb Polytenní chromozomy Vyskytují se ve slinných žlázách Obrovský potenciál pro mnohostranný genetický výzkum, jsou složeny z celkem 1024 paralelních vláken (polytenizují pouze euchromatinové oblasti) Obsahují celkem 5100 proužků po nabarvení Puffy jsou místa chromatinu spojená intenzivní transkripcí projevující se dekondenzací chromozomů Známé genetické mechanizmy Tvorba pohlaví dominantní gen Sex-lethal Transgenoze u drozofil Volba transgenu Volba promotoru Volba signálního genu Kolekce vajíček Jehly Mikroinjekce Selekce trangenních organizmů Promotory Spolehlivost exprese ­ vysoká hladina transkripce transgenu Exprese ve vhodném vývojovém stadiu Tkáň, ve které dochází k expresi Nejčastěji používané promotory LSP ­ larvální sérové proteiny HSP 70 ­ promotor heat shock proteinu 70 Signální geny Důkaz úspěšné transgenoze Gen rosy ­ kóduje enzym xantin dehydrogenázu Gen white ­ bílá barva očí Kolekce vajíček Kladení 15-30 min Orientace vajíčka Mikropyle ­ anterierní pól Injekce do posterierního pólu Dechorionace (mechanická, chemická) Fixace vajíček na podklad Desikace (10 min při 18 °C) Mikroinjekční jehly Tloušťka jehly Savci v jednotkách m Zebra fish 5-10 m Drosophila okolo 10 m Špice jehly Po zlomení (drozofila, ryby) Broušení (savci) Mikroinjekce Prostředí Olej (Voltalef oil) Teplota Čas (syncytium dělících se buněk) Množství Místo injekce Mikroinjekce Volba transgenu Nutná znalost vlastních genů Modely funkce cizorodých genů Lidské geny pro metabolizační enzymy (CYP1A1, 1A2, 2D6 ..) Sledování promotorů Modely funkce prionů Hybridní dysgeneze Křížení samečků P kmene (nesoucí P- elementy) se samičkami M kmene Výskyt mutací, rekombinací a chromozomových přestvaveb P-elementy Autonomní 2,9kb, kódují transponázu, deletované koncové 31pb repetice, neschopný začlenění Defektní, deletovány určité oblasti čtecího rámce kódujícího transoponázu, koncové repetice má úplné, nese transgen, je mobilizován transponázou autonomího elementu Hybridní dysgeneze Embryogeneze 1.-13. cyklus 2 hodiny, bez celularizace Syncitiální typ embrya 14. cyklus tvorba buněčných stěn Lokalizace Specializace Spuštění genů formujících anterior- posteriorní osu 25 segmentačních genů (Gap, Pair-rules, Segment polarity) 7 homeotických genů (Antennapedia a Bithorax komplex) Primární transkript Antp genu 103 kb ­ 90 min syntéza Embryogeneze Embryogeneze Embryogeneze Embryogeneze Exprese engrailed-lacZ Praktické aplikace Využití v testech genotoxicity Praktické aplikace Využití v testech genotoxicity Praktické aplikace Využití v testech genotoxicity Praktické aplikace Využití v testech genotoxicity 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 poč.mutacínakřídlo 0 0,01 0,1 1 5 10 koncentrace [ml/l] Test dibenzo[a,h]anthracenu lacZ hgst2c hgst3c Praktické aplikace Využití genu engrailed v testech genotoxicity Praktické aplikace Využití genu engrailed v testech genotoxicity