RNA Nestabilita RNA Stabilizace RNA a uložení RNA v diagnostice Přímá RNA diagnostika Struktura NF1 genu - 350 kb - 60 exonů - 11 - 13 kb mRNA - protein neurofibromin - 2818 aminokyselin - zřejmě tumor supresor Komplikace při molekulární diagnostice NF1 - problematická klinická diagnostika - až 50 % případů de novo - vysoká mutační rychlost - velikost genu (350 kb, 60 exonů) - absence hot spot oblastí - nutnost vyhledávání v celém genu - nejasná korelace mezi typem mutace a formou postižení - neurofibromin - známa funkce pouze jeho centrální domény - různé klinické projevy i u pacientů nesoucích stejnou mutaci Strategie molekulárně-genetického testování NF1 pacientů Vazebná DNA analýza v rodinách s výskytem NF1 onemocnění Vazebná DNA analýza v rodinách s výskytem NF1 onemocnění SSCP DGGE Sekvenace vzorku DNA s odlišnou elektroforetickou mobilitou cDNA - SSCP analýza 1 2 3 4 5 6 7 8 Obr.2 : cDNA /SSCP analýza segmentu P7 NF1 genu (exony 28 32/33, 1102 bp) dráha 1: standardní DNA dráhy 2 - 8: DNA NF1 pacientů dráha 7: DNA NF1 pacienta s C5242T mutací (detekce v P7A) dráha 8: DNA NF1 pacienta s C5839T mutací Electroforetické podmínky: 10% PAGE, 600V/14^oC/4,5hod. Sekvenace cDNA segmentu P7 NF1 genu ( exony 28 -32/33) Výhody a nevýhody RNA dignostiky genu NF1 - jednodušší a rychlejší skríning multiexonického genu (10 segmentů cDNA místo 60 exonů), mRNA je bez intronů - záchyt sestřihových mutací v intronech - záchyt delece celého exonu na jedné alele genu - nižší ekonomické náklady - složitější odběr krve pro izolaci RNA - nižší stabilita RNA - dlouhé úseky genu NF1 - obtížnější elektroforetická separace a sekvenace - nejasný efekt mutace na fenotypové úrovni (stejné u DNA diagnostiky!) Polytymidinové varianty v intronu 8 genu CFTR Porovnání podílu normalní CFTR mRNA, klinických fenotypů a CFTR genotypů. PCR analýza alel polyT sequencí v intronu 8 CFTR genu Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exon 9 na LightCycler Transcripty byly izolovány z leukocytů perifrní krve. Kvantifikace cDNA PCR produktu CFTR exon 9 na LightCycler Transcripty byly izolovány z buněk bukální sliznice Detekce minimální reziduální choroby u solidních nádorů RNA diagnostika neuroblastomu • 1.enzym dráhy syntézy katecholaminů • katecholaminy - důležité neurotransmitery a hormony, regulují vnitřní funkce a motorickou koordinaci - jsou sekretovány 98% NB (NB je endokrinně aktivní) - jejich metabolity používány pro sledování průběhu onemocnění • exprese TH genu je regulována tkáňově specificky během neonatálního vývoje a diferenciace Biosyntéza katecholaminů Schéma TH mRNA Strategie detekce exprese TH genu E Izolace mRNA (PB, BM, tkáň nádoru) Ë RT-PCR TH cDNA I PCR TH syntéza úseku DNA odpovídajícího mRNA pro TH TH syntéza DNA pro βμG (provozní gen) - kontrola kvality RNA a RT Í ELFO - 5% PAGE, barvení stříbrem ~ Fragmentační analýza (ABI PRISM) Î Stanovení citlivosti TH RNA izolovaná z NB buněčné linie IMR-32 Citlivost detekce TH mRNA - PAGE Citlivost detekce TH mRNA - fragmentační analýza 2) Detekce exprese genů MAGE a GAGE • Genové rodiny • Kódují nádorové antigeny • Jejich produkty (vázané na MHC) jsou rozpoznávány cytotoxickými T lymfocyty • Exprimovány širokým spektrem lidských nádorů (NB, melanom, Synovial sarkom, NF1, k.plic, žaludku, prsu...) Molekulární markery neuroblastomu • Tkáňově specifická exprese TH genu - buňky NB – Detekce v KD, periferní krvi - cirkulující buňky NB – Vysoká citlivost detekce(~1b./10^4-5) • Nádorově specifická exprese buněčných antigenů MAGE, GAGE – kombinací více molekulárních markerů je možno postihnout heterogenitu NB- zvýší se pravděpodobnost záchytu NB – možnost zavedení a aplikace DNA vakcín • Klinický význam: ë stanovení diagnosy ë určení prognosy ë sledování průběhu onemocnění (MRD, relaps) ë detekci NB buněk v transplantátu před autologní transplantací • jeden z nejčastějších nádorů měkkých tkání u dospělých (vedle maligního histiocytomu, liposarkomu a rhabdomyosarkomu) • tvoří 5,6% - 10% sarkomů měkkých tkání • histologicky je možno klasifikovat 4 typy: bifázický typ monofázický fibrózní typ monofázický epiteliální typ špatně diferenciovatelný typ Klinické nálezy Věk a pohlaví pacientů: • prevalence výskytu choroby je mezi 15-40 rokem života, jen zřídka se objevuje u pacientů mladších 10 let a starších 60let • poměr postižených mužů a žen je 1,2 :1,0 • Prognostické faktory • Klinická diagnostika Synovial sarkomu • radiografie (CT, MRI) • mikroskopie (odlišení jednotlivých typů buněk nádoru: vřetenovité x epiteliální) • imunohistochemie (cytokeratin, epiteliální membránový antigen) • ultrastrukturní nálezy epiteliálních a vřetenovitých buněk • cytogenetické nálezy : t(X;18) • molekulárně-genetické nálezy (fůzní gen SYT/SSX1,2) Cytogenetika • translokace t(X;18)(q11;Xp11) nalezena v 95% případů pacientů se synoviálním sarkomem * jiné chromosomální aberace jsou častěji pozorovány v metastatických tkáních než v primárním nádoru * metodou komparativní genomové hybridizace (CGH) byl u pacientů s více než dvěma chromozomálními aberacem zjištěn i dřívější výskyt metastáz Molekulární diagnostika Struktury variant chimerického fúzního transkriptu SYT-SSX1/2 Strategie molekulárně-genetického vyšetření • izolace RNA z tkáně nádoru (pro potvrzení diagnozy), krve nebo kostní dřeně(pro sledování MRD) • RT-PCR: přepis informace z RNA do cDNA zachycení fúzního transkriptu SYT/SSX1,2 • štěpení PCR produktu restrikčními enzymy, pro rozlišení fúzního partnera genu SYT • určení citlivosti reakce pro využití při sledování minimální residuální choroby Biologická funkce genu SYT a genů SSX • geny SYT,SSX a SYT/SSX kódují jaderné proteiny, jejichž funkce není zatím přesně známa • SYT gen je vyjádřen v časné embryogenezi • exprese SSX2 genu byla detekována u pacientů s maligním melanomem, u 25-30% pacientů s nádorem prsu a tlustého střeva • chimérický gen SYT/SSX kóduje protein,kde 8 posledních AK zbytků je nahrazeno 78 AK zbytky z C-konce SSX proteinu * SYT-protein:ko-aktivátor transkripce, SSX-protein:ko-represor (Santos, 2002), SYT/SSX-protein:C-konec SSX domény přesměruje SYT-aktivační doménu na nový cílový promotor (Thaete 1999)