Molekulárně genetická diagnostika Genom Genom x Genotyp Human Genome Project Projekt lidský genom HUGO - cíle Nárůst údajů o sekvenci DNA DNA diagnostika Hlavní cíle: • potvrdit diagnózu choroby, která je podmíněna genovou mutací • zjistit genetické dispozice k onemocnění v rodinách s určením rizika u potomků Přímá DNA diagnostika • Detekce mutací v odpovědném genu vždy potvrdí klinickou diagnózu musíme znát: 1 gen , který má být analyzován 2 standartní (wild type) sekvenci tohoto genu Přímá DNA diagnostika • Metoda přímé detekce již známých mutací Mutace Mutace Hlavní třidy mutací • delece od 1 bp po megabáze • inzerce včetně duplikácí • jednobázové substitutce missense transverze nonsense tranzice splice site • posunové (frameshift) v důsledku delecí, inzercí, poruch splicingu • „dynamické“ (expanzia rep. sekv.) tandemové repetice, které často expandují během meiózy Podle sekvence: - v kódující sekvenci v nekódující sekvenci Typy mutací dle funkce Přímá DNA diagnostika Přímá DNA diagnostika • Metody přímého vyhledávání neznámých mutací (scenning) - odhalí jakékoliv odchylky v sekvenci DNA pacienta, avšak vždy jen ve srovnání se standartní sekvencí - neodliší patogenní a nepatogenní změny v sekvenci DNA - jsou náročnější časově i finančně Princip metody DGGE SSCP na gelu SSCP v kapiláře SSCP na gelu Cystická fibróza Základní fyziologický defekt při onemocnění CF Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Protein CFTR Mutace: CFTR mutace • 1291 CFTR mutací bylo nalezeno v CFTR genu (CFTR Mutation Table; http://www.genet.sickkids.on.ca./cftr-cgi-bin/FullTable • Většina z nich je raritní, „privátní“ nebo jejich vztah k CF nebyl prokázán • Z celkového počtu 30ti doposud u nás nalezených mutací (zahrnujících celkem 95% všech CF alel) se pouze 8 mutací vyskytuje na více než 1% CF patologických alel • Je pozorováno široké rozpětí ve frekvenci jednotlivých mutací u různých populací • Nejčastější mutatace dF508 je detekována u cca 70% CF pacientů Mutace v genu CFTR u českých CF pacientů • dele2,3(21kb) 4,64% • G551D 4,03% • N1303K 3,02 % • G542X 2,22% • 1898+1GtoA 2,02% • 2143delT 1,21% • R347P 0,81% • W1282X 0,60% • 4374+1GtoA, 1717-1GtoA, R1162X, E92X, 2184insA, 3849+10kb každá 0,4% • R334W, R553X, 621+1GtoT, ........ každá 0,2% CF - autosomálně recesivní dědičnost CF polysystémové onemocnění Pankreas Plíce Fertilita nemocných CF Cílená mutační analýza CFTR genu je prováděna: • A, pro potvrzení diagnosy 1. u pacientů s dg. CF 2. u členů rodin s výskytem CF 3. prenatálně u plodů v riziku s pozitivní CF rodinnou anamnézou 4. prenatálně u plodů s patologickým ultrazvukový nálezem (abnormalita střevních kliček) 5. u novorozenců s mekoniovým ileem 6. u mužů s poruchami reprodukce Izolace DNA Biologický materiál pro izolaci DNA Detekce 5ti nejčastějších CF mutací klasickými molekulárně genetickými metodami Detekce mutace dF508 Detekce CF mutací G542X, G551D, R553X SSCP analýza PCR produktů exonu 11 Detekce mutace CFTRdele2,3(21kb) ELFO: 5% PAGE, 200 V, 20°C, 2hours Rodokmen rodiny P. Pacient J.F. Využití Real – Time PCR v detekci CF mutací Rodina E.,K. Pacientka Z.V., 15 let důvod vyšetření: rok trvající kašel • CT prokázalo četné bronchiektasie v obou horních plicních lalocích • hyperplazie maxillárních, nosních a sphenoideálních dutin • pankreas, játra bez odchylek • vyšetření chloridů v potu opakovaně se zvýšenými hodnotami (82 - 88 mmol/ml) • zvažována dg.CF Pacientka Z. M., 6 let důvod vyšetření:časté infekty,trvalý kašel Výsledek mutační analýzy genu CFTR genotyp: R347P / 711+5 GtoA dg. CF potvrzena Analýza celé CFTR kódující sekvence a přilehlých oblastí Duchennova muskulární dystrofie • těžká X-recesivní monogenně dědičná choroba • primární příčina: mutace v dystrofinovém genu (Xp21) • incidence choroby 1:3500 novorozených chlapců • destrukce svalových vláken • fenotyp: 1) špatné držení těla, potíže při zvedání se ze země 2) narůstající svalová slabost 3) pseudohypertrofie lýtek 4) lordóza • většina pacientů má abnormální EKG • zvýšenou hladinu kreatinkinázy • někteří trpí gastroparézou • 1/3 vykazuje mírnou mentální retardaci Inverze v genu F8: najčastejší příčina hemofílie A TR - trinukleotidové repetice • široce rozšířeny v lidském genomu * v intronech * uvnitř čtecích rámců (exonech) - v překládaných - nepřekládaných Rozdělení chorob zapříčiněných expanzí trinukleotidových repetic podle lokalizace TREs 1 TR lokalizovány uvnitř ORF 2 TR lokalizovány vně ORF - v 3´UTR nebo 5´UTR - v intronech Přehled a základní charakteristika některých chorob asociovaných s expanzí trinukleotidů Myotonická dystrofie typu 1 DMPK gen DMPK protein neovlivněná funkce DMPK proteinu vznik patologického fenotypu neobjasněn pravděpodobné příčiny vzniku MD: • narušený transport a úprava mRNA • narušení struktury chromatinu expandovaným repetitivním traktem porucha exprese genů lokalizovaných v okolí genu DMPK • vysycení DNA vazebných proteinů narušení funkce genů v okolí genu DMPK Klinická anticipace spojená s expanzivním prodlužováním trinukleotidových repetic asymptomatický prarodič (MD1 : 5 - 50 CTG repetic) Korelace genotypu a fenotypu u MD1 Kongenitální MD (CMD) Pohlavím ovlivněné efekty na transmisi CMD Diagnostika MD1 PCR P1/P2 Strategie molekulárně genetického vyšetření MD1 TP PCR PCR ( P1/P2) Stanovení dg. MD1 při prenatálním vyšetření Srpkovitá anemie Srpkovitá anemie