LECEBNE METODY CHIRURGIE OZAŘOVÁNÍ CHEMOTERAPIE BIOLOGICKÁ TERAPI rcraTsiBnffl ► platinové deriváty :aooiny imexacrexax.^^Mura etoposid) Dpoizomeraz ^aoxoru ► alkylační činidla (cyklofosfamid) ►rostlinné alkaloidy (vinblastin, paclitaxel) Biologická terapie - hledání nových přístupů na základě poznání mechanismů ► Stimulace obranných mechanismů hostitele včetně specifických a nespecifických imunologických přístupů (imunoterapie) Strategií iogenní teraüie - - cílená t>roti vr aBfOn'M'fiUmlaiwttia ;enu. IIIIBWtgltJI KKltailKU ízaci iirumil! Podpůrná (symptomatická ) léčba Nemá za cíl smrt nádorových buněk, ale usiluje o co nejlepší kvalitu života nemocných (zmírnění obtíží vyvolaných nádorem a léčbou) Paliativní léčba - komplexní podpůrná léčba u pacientů s pokročilým nevyléčitelným onemocněním Kurativní léčba - cílem je vyléčení nemocného Nekurativní léčba - cílem je zabíjet nádorové buňky, ale nemá ambice vyhubit všechny (pokročilé onemocnění, rezistence na léčbu atd.) Adjuvantní léčebné postupy -chemo- nebo radio-terapie - u těch nádorů, kde je předpokládána přítomnost mikrometastáz, nutná chemosenzitivita nádoru Neoadjuvantní postupy - predoperační léčba s cílem zmenšit primární nádor před chirurgickým výkonem Vznik a vývoj nádoru je složitý děj, který závisí na překonání řady reštrikční ch mechanismů na úrovni genomu, buňky, tkáně i celého organismu a který pro svou komplexnost vyžaduje při plánování terapie individuální přístup (tailoring therapy) - využití poznaných biologických charakteristik Klinické - staging (jeden z nejsilnějších prognostických faktorů), sledování přežití a ireg4ffi&o c i n o vtai Orgí Tkáň mH« laBmiWsmliffl 3sk5ü£ ipovědi nádoru na léčfr histologická charakteristika, grading, tkáňová architektonika, sní profily-imunohistoche Buněčná - - funkční testy, obsah DNA, proliferační Molekulární - cytogenetické a genetické charakteristiky nádorových a somatických buněk Incidence nádorových onemocnění se stále zvyšuje. Přesto je dlouhodobá mortalita téměř konstantní díky výrazným léčebným a diagnostickým pokrokům. Nové léčebné postupy, nová chemoterapeutika, kombinovaná ter~ nových poznatků o biologii nádorové buň mumtmtmUmí liraimiin 3fl |MJHI&llHRHIWBt^MMIÍiítllMÍMIllTeriferní krve účinnosti cytotoxických léčiv vybuzením klidových leukemických buněk Nejběžnější využití CSF (colony stimulating factors) - prevence a ovlivnění myelosuprese - intenzifikace chemoterapeutických programů s nebo bez autologní podpory progenitorů z kostní dřeně (KD) nebo periferní krve - rekonstituce krvetvorby po chemo- a rádioterapii a autogenní nebo allogenní transplantace KD - podpora a expanze progenitorů periferní krve - stimulace hemopoézy u syndromů poruch v KD jako je cyklická neutropenic, aplastická anémie - aktivace efektorových buněčných funkcí (AIDS, poruchy funkce leukocytu) - pomocí růst. faktorů lze také buňky v GO fázi, kdy jsou rezistentní k působení cytostatik posunout do buněčného cyklu CML je klonální myeloproliferativní porucha primitivních hemopoetických kmenových buněk. Zahrnuje myeloidní, erytroidní, megakaryocyt., B- někdy T-lymfoidní elementy, ale ne fibroblasty kostní dřeně (KD). Nemoc je silně heterogenní, má 2 až 3 fázový průběh, je přítomen chromoz. marker - Ph chromozom. V minulosti byla prognóza pacientů s CML velmi špatná (stř. doba přežití 3 roky). Nyní se prognóza zlepšila díky včasné diagnóz léčbě. Léčba hydroxyureou a busulfanem podporovaná IFN a autologní trän«, Nyní je stř. doba přežití asi 60-65 měsíců. S IFNalfa 20-25% pacientů přežívá. 'a, nechutenství, svalové bolesti, dlouhodobější ■■ ztráta vá1 atä^^Asi - nem mozna MDS je získaná klonální porucha kostní dřeně charakterizovaná kvantitativními i kvalitativními poruchami V hpmnnnpzp fhnHnč ii ctřirQiWi li H í - n pní mn7ná drastická terapií Řada léčebných protokoluje zaměřena na využití diferenciační ch látek k podpoře zrání blokovaných buněk. Existují in vitro modely, kde je možno pomocí retinové kyseliny, DMSO nebo vit D3 příp. G-CSF, GM-CSF. Avšak v praxi u pacien+ nepřinášejí žádoucí výsledky. Leme iNWti JDS má •/ v« translokace 15,17 důležité pravděp. pro klinický účinek ATRA). t?^v^™k;^o^+^í ww fokAr,7 i^A ^A/ÍCSF a IL-3 jsou u MDS paci _:h bílých* M rol [tilťílKl* bsen B ^*^ v+wj m m wwM m«nimi» m* i»ii^w ■• n q^wj ■ uaifiii MnOEMlIä MguiaraftiCTCT^^ragíTiíiiM iMiraiiwgwiirt ^^^^| Chemoprevence a chemoterapie HEALTHY CELL GENETIC MUTATIONS THAT CAN LEAD TO CANCER &>, <& ^ %*, <* PROGRAMMED DEATH OF ALTERED CELLS (APOPTOSIS) # ,;3 •11 ;-^o-^--->v;:;:V PROCESSES THAT LEAD TO EXCESSIVE PROLIFERATÍON OF GENETICALLY DAMAGED CELLS DAMAGED CELL (PRECANCEROUS) CANCER CELLS t*' * Z Q KÄS DIFFERENTIATION OF CELLS DĚDIČNOST NÁDOROVÝCH ONEMOCNĚNI Genetika, mutace specifických genů - zvýšená náchylnost (susceptibility) k určitým typům nádorů Prevence - „family trees", cytogenetické am^'™ mTOt £*££—£■——KB m .... ^ ,, ^"5 U /''^HÍIItĚ& :■ ' ' '." ■ ■ k5S ■•■■ ' ' jSPvtS ■■ Jw íral&S BB-l-W *£■ jft 7| Pp^~ -1 7, A 1 ■ - k W / 1 1 P ^ i - ' I ij 1 lili /L-sLí 1 ■ 1 VQ H i Ä B k—T' ■HB CHEMOPRE VENCE Přírodní nebo syntetické látky, zasahující v ranných fázích karcinogeneze. Aktivují detoxifikační enzymy, antioxidační účinky - laboratorní a epidemiologické studie q-tokoferol, ß-karoten, vitamin A a retinoidy - zelenina, ovoce Dithiolthiony, sulforaphan - brokolice, květák, kapusta Genistein - sója la»ii8«HtiIiElratmiirera Tamoxifen - antiestrogen - prevence u žen se zvýšeným rizikem vzniku nádoru prsu Nesteroidní antiflogistika (NSAID) - aspirin, piroxicam, sulindac - prevence kolorektálních nádorů Finasteride (blokuje přeměnu testosteronu na androgen) - prevence nádorů prostaty DFMO - difluorometylornitin (blokuje aktivitu ornitin dekarboxylázy) - prevence různých typů nádorů Representative members of four classes of new chemopreventive agents, whose mechanism of action is known Selective COX-2 Inhibitors Selective Binding to RXR (Retinoids) SIT CF* Celecoxib COOH LG 100268 R Ms PPAH-yLigands OCH3 COOH OCH, LY353381-HCI GW 7Ö45 Six patterns for the cyclization of squalene are shown here; numerous other variations exist in nature LANOSTANE DAMMARAME OLE ANAHE ^-TARAXASTANE FHIEDELAHE Oleanolic and ursolic acids Squalene (CM) Specific Cyclase \Specific Cyclase COOH 'COO H Oleanolic Acid (OA) (Cso) Ursolic Acid (UA) (C30) Oleanolic and ursolic acids, which have been used as chemopreventive agents, are both derived from squalene. Note that the two structures differ only in the location of the two methyl groups in the E-ring. Families of Chemotherapeutic Drugs ANTIMETABOLITES Some anticancer compounds act as false substances in the biochemical reactions of a living cell. A prime example of such a drug is methotrexate, which is a chemical analogue for the nutrient folic acid. Methotrexate functions, in part, by binding to an enzyme (orange) normally involved in the conversion of folic acid into two of the building blocks of DNA, adenine and guanine. This drug thus prevents cells from dividing by incapacitating their ability to construct new DNA. METHOTREXATE DNA TOPOISOMERASE INHIBITORS Replication of a cell's genetic material requires a means to pull the DNA double helix apart into two strands. This separation is typically accomplished with the aid of a special "topoisomerase" enzyme (orange) that temporarily cleaves one strand, passes the other strand through the break and then reattaches the cut ends together. Drugs that inhibit the ability of topoisomerase enzymes to reattach the broken ends cause pervasive DNA strand breaks in cells that are dividing, a process that causes these cells to die. ALKYLATING AGENTS Certain compounds (orange) form chemical bonds with particular DNA building blocks and so produce defects in the normal double helical structure of the DNA molecule. This disruption may take the form of breaks and inappropriate links between (or within) strands. If not mended by the various DNA repair mechanisms available to the cell, the damage caused by these chemicals will trigger cellular suicide. Examples: methotrexate, fluorouracil, gemcitabine Examples: doxorubicin, CPT-11 Examples: cyclophosphamide, chlorambucil PLANT ALKALOIDS Certain substances derived from plants can prevent cell division by binding to the protein tubulin. Tubulin, as its name implies, forms microtubular fibers (pink) that help to orchestrate cell division. These fibers pull duplicated DNA chromosomes to either side of the parental cell, ensuring that each daughter cell receives a full set of genetic blueprints. Drugs that interfere with the assembly or disassembly of these tubulin fibers can prevent cells from dividing successfully. Examples: vinblastine, vinorelbine, paclitaxel, docetaxel 1 Expozice buněk velmi nízkými dávkami chemoterapeutik má minimální efekt na viabilitu nebo bun. cyklus díky dostatečným schopnostem reparačního systému opravit poškození. Ve vyšších konc. v závislosti na přítomnosti nebo nepřítomnosti kontr. bodu v Gl (souvisejícího s expresí p53) se vyskytují 2 typy odpovědi: ► v případě funkčního kontr. boduje bun. cyklus zastaven v Gl dokud nedojde k opravě poškození nebo dochází ke spuštění apoptózy při velkém rozsahu poškození (po vysokých konc.) nebo neúspěšné reparaci. ► jestliže je kontr. bod nefunkční (např. při mutaci p53) buňky vstupují do S fáze, ale postup (DNA replikace) je suprimována podle konc. látky. - v případě buněk „primed" k apoptóze, dojde k apoptóze rychle (3-6 h, „immediate apoptosis") u prahových hodnot konc, slabě nad těmi, které kompletně inhibují progresi S fáze. - v případě non-primed buněk prodloužená suprese průchodu bun. cyklem (defective progression) vede k růstové nerovnováze, sekundárním změnám, následnému nastartování a pozdní apoptóze. Tato apoptóza vykazuje často atypické vlastnosti, komlikované růstovou nerovnováhou a sekundárními změnami metabolismu. - při ještě vyšších konc. překračujících farmakologickou dávku dochází k nekróze. Nádorové tkáně mají, analogicky jako normální tkáně, proliferující část populace a část populace neproliferující, která se skládá z klidových buněk v GO fázi nazývané někdy také populace kmenových neoplastických buněk. Tyto buňky je obtížné zničit, protože jsou rezistentní k cytostatickému působení záření nebo chemoterapeutik. Určitou lem ifiJZän Opakovaná cytostatická terapie a kombinovaná terapie (s využitím humorálních [rnmjBitmmitfaij klidové buňky, a pak účinně inhibovat jejich rust. Klíčovou otázkou však zůstává volba nejvhodnějšího časového intervalu mezi jednotlivými aplikacemi (matematické modely). >em dlouhého časového inte bělením chromosomuje poš genetický materiál reparován. ;ou citlivé na cytostatickou terapii, frakce neproliferujícíd ijí krátkou generační dobu. Opakovaným působením lze při GO buňky do cyklu a účinně inhibovat růst (lymfomy, seminomy, některé leukémie). 7 mají přechod buněk z GO zásobní populace řízen negativní _3chanismus udržuje vždy minimální hladinu GO buněk,: kterých se populace vždy obnovuje. Tyto nádory jsou rezistentní na cytostatickou terapii a je velká pravděpodobnost vzniku rezistentních klonů. Buňky mají dlouhou generační sarKomyj. Cell Cycle Progression Normal Defective (delayed apoptosis) No effect Cytostasis Immediate (Repair) ^V0^ Apoptosis Necrosis („Primed" cells) Drug Concentration Generalized scheme illustrating the effects of increasing concentrations of DNA damaging antitumor drugs, on cell cycle progression and apoposis. Exposure of cells to very low drug concentrations has generally no, or minimal, effect on their viability or cell cycle, most likely due to the fact that the rate of DNA repair exceeds the rate of accumulation of the lesions. At higher drug concentrations, depending on the presence or absence of the G1 checkpoint (which is associated with expression of tumor seppressor gene p53) two types of responses occur: a) In the presence of a functioning checkpoint, cell progression through G1 is halted until the lesion is repaired. Alternatively, apoptosis is triggered when the damage is extensive (high drug concentration) or repair unsuccessful, b) If the G1 checkpoimt is malfunctioning (e.g., as in the case of of mutation of p53) the cells do enter S, but the rate of progression (rate of DNA replication) is suppressed proportionally to the drug concentration. In the case of cells „primed" to apoptosis, apoptosis generally occurs very rapidly (3-6 h, „immediate apoptosis") at the threshold drug concentration, slightly above that which completely halts their progression through S [Del Bino et al., 1991]. Cell priming to apoptosis may be associated with, among other factors, constitutive expression of c-myc. In the case of „nonprimed cells," prolonged suppression of cell cycle progression by the drug („defective progression") leads to growth imbalance, secondary changes, their subsequent „priming" (developmet of effectors), and delayed apoptosis. Delayed apoptosis may often have atypical features, complicated by growth imbalance and secondary changes in cell metabolism [Kung et al., 1990]. Necrosis ic coon at cti 11 hinhor rlriin ^rm^ontratirin nonorallu ahnx/o itc nharma^rklnni^sil louol Table 2* Dm g Inducers of Oxidative Stress Anthracyclines Epipodophyllotoxins Camptothecins Platinum coordination complexes Bleomycins Alkylating agents Table 3* Potential Mechanisms for Aldehyde Interference of Cancer Therapy Effectiveness Prolong G-| Inhibit Go to Gi transition Checkpoint arrest Restriction point block Inhibit drug-induced apoptosis Caspase inhibition Death receptor binding More apoptosis of Cancer cells Less apoptosis of Normal cells Increased efficacy + reduced toxicity = therapeutic benefit Figure 1 Desirable strategy to achieve therapeutic benefit in cancer therapy. Agents which effectively kill cancer cells are useful to the extent that toxicity to normal cells is tolerated. It is clear that therapeutic benefit can be achieved by increasing apoptosis of cancer cells as well as by lowering toxicity to normal cells upon exposure to anticancer therapy aptotic Chemotherapy Death Receptor Activation Cellular Damage Cytochrome c Release Caspase 8 Activation Caspase 9 Activation Activated Caspase Cascade APOPTOSIS by causing release of cytochrome c from mitochondria or by activation of death receptors. These proapoptotic events result in activation of unique proteases, caspase 8 and caspase 9, which are termed initiator caspases because they activate other caspases (effector caspases) that carry out disassembly of the c_... Activation of Apoptosis Pathways by Anticancer Therapy Drugs / Irradiation 9 "stress pathway" * iüöiJNK/SAPK> [ casp3 V CAD/ICAD \ DNA Fragmentation substrates t Figure I Apoptosis pathways in anticancer therapy, Apoptosis pathways can be triggered through different entry sites, for example, at the plasma membrane upon crosslinking of death receptors (receptor pathway) or at the mitochondria (mitochondrial pathway). Stimulation of death receptors of the TNF receptor superfamily (DIL-R) such as CD95 (APO-l/Fas) or TRAIL receptors by DIL results in receptor aggregation and recruitment oi' the adaptor molecule F ADD and easpasc-S into a DISC. Caspase-8 becomes activated upon recruitment and initiates apoptosis by direct cleavage of downstream efieetoreaspases. The mitochondrial pathway is initiated by the release oi" apoptogenic factors such as cytochrome t\ or Smac from mitochondria into the cytosol. The release of cytochrome c into the cytosol triggers caspase-3 activation through the formation of the cytochrome tiv'Apaf-l/caspase-9-containing apoptosome complex, Smac promotes caspase activation through neutralizing the inhibitory effects to IAPs, while A IF causes DNA condensation. The receptor and the mitochondria] pathway can be interconnected at different levels, for example, through Bid, a BH3 domain-containing protein of the Bel-2 family, which assumes cytochrome r-releasing activity upon cleavage by easpase-S. Activation of caspases is negatively regulated at the receptor level by FLIP, which block caspase-8 activation, at the mitochondria by Bel-2 family proteins and by IAPs. AIF, released from mitochondria mediates caspase-independent large-scale DNA iragmcntation after translocation to the nucleus ypy bunečné smrti po působení protinádorových terapeutik A tu E tissue Necrosis cytotoxic agent (dose) Figure 3 Forms of cell death caused by anticancer drugs (cytotoxic stimuli). At low (subcytotoxic) doses, a drug (or other cytotoxic agents) can arrest cell proliferation without significant cytotoxicity. At higher drug concentrations, apoptosis-prone cells undergo rapid cell death caused by ca spase activation. Apoptosis-reluctant cells may either recover or undergo slow cell death. At maximal cytotoxicity, rapid necrosis may occur in any cell types Mechanismy rezistence ke xenobiotikům rezistence může být důsledkem ► snížené vnitrobuněěné koncentrace látky díky změněnému příjmu do nitra buňky, zvýšenému vylučování z buňky nebo rozložení v buňce ► zvýšené buněčné detoxifikace (inaktivace) ► kvalitativních nebo kvantitativních změn buněčného cíle (enzymu) ► neschopnosti přeměňovat látku na aktivní formu ► poruch v drahách apoptózy IMfBBi ote my v [SE^eliSíS/SiS^^E^^^^KgMiiKigiBäí^lH Vylučování látky z buňky je spojeno s aktivitou specifických proteinu nebo proteinových komple^ MDR - "multidrug re IWHIWHMMlBMWmTlSTOirailItiraiglMlJ spojené se zvýšenou expresí Pgp (PÍ70) glykoproteinu ■■ membránová adenosin trifosfatáza (ATPáza) se širokou specifitou. Transportuje endogenní substance ítabolity, odpad, hormony atd.). irmakologická funkce spočívá v protekci proti cytotoxickým látkám. Mechanismus MDRje posledních 10 let intenzívně studován. Byl izolován lidsk: ;en MDR1 na chromosomu 7. Tento gen kóduje Pgp a jeho exprese je spojena s MDR fer O Decreased drug \ .•***♦ influx Increased drug efflux Drug Activated drug Inactivated drug Detoxified drug Buněčné mechanismy lékové rezistence Regular way of target inhibition ■> Different ways of resistance Buněčná detoxifíkace Základní roli v rezistenci nádorových buněk k různým cytotoxickým látkám hraje glutation (GSH) - vnitrobuněěný tripeptid obsahující cystein a přítomný v savčích buňkách ve vysokých koncentracích. Zvýšená konjugace s GSH je hlavním mminiagi Glutation-S-tranferázy (GST) - čtyři známé izoenzymy - jsou hlavní skupinou detoxifikačních enzymů. Protože katalyzují konjugaci s GSH, je hladina jej ich exprese hlavním faktorem určujícím senzitivitu buněk. GSH i GST mohou způsobovat rezistenci i jinými mechanismy než konjugací, např. ™TT 0^ íodulovat reparační funkce DNA atal 1 -----1 J *----- ' cisplatině. Využití inhibitorů GSH - indometacin, piriprost Rezistence k chemoterapii zprostředkovaná změnami buněčného cíle Změny topoizomerázy - topoiz. lije zásadní pro replikaci DNA - cíl interkalačních látek jako je adriamycin, actinomycin D nebo neinterkalačních látek jako jsou etoposide nebo teniposide. Rezistence muže být způsobena změnou hladiny topoiz. II nebo expresí mutovaného enzymu. rMiiíMtvmw c\\ tSfíMWammi^Rm^HVJ^MKW^imnimimmm wilKlraantTrlľi^Hifjil hladina DHFR je příčinou rezistence. Změny tymidilát syntázy - cíl 5-fluorouracilu. Dva mechanismy rezistence - změny " TS k lékům díkv substituci iedné aminokyseliny nebo zvvšená TS aktŕ" U31 ^!!Jľ iBiiraairarawíro Zvýšené reparační funkce DNA DNA je cílem různých cytotoxických látek. Přímou nebo nepřímou vazbou k DNA způsobují tyto látky změny v DNA a genomové poruchy vedoucí k buněčné smrti. Jednoduchá alkylační činidla se kovalentně váží k DNA - vnitrf vazby. Derivátv kovů i ako i e cisülatina tvoří také podobné vazby. Cisplatina obecně porušuje :omy dvou sousedních guani menší míře indukcí meziřetězcových vazen a monoaduktů. Další cytotoxické látky jsou schopny nekovalentně se vmezeřovat do DNA. Ačkoliv všechny tyto interakce s DNA jsou potenciálně letální, rozsah buněčné í ovlivňován rozdíly v rozsahu reparaci Existuje inverzní vztah mezi buněčnou reparací a cytotoxickou senzitivit mSĚS^M >euca Uli I]č^^^5^Q5t mm ďAlffAl _ ínů. Mají velký význam pro nado.-chemoterapii, protože jsou zahrnuty v rezistenci k velkému počtu cytotoxických látek, LWgiKBK&UBd^^ neis tuKtyjiiaiwii KM||U|AXAaiK|2i8| Tři hlavní typy reparace DNA: Reverze poškození - nejjednodušší biochemický pochod obnovující integritu DNA. 06 -alkylguanin DNA alkyltransferáza přispívá hlavním dílem k rezistenci k alkylačním činidlům - inhibice enzymu významně zesiluje cytotoxické účinkv látek. Bohužel, tento lory, protože tento i karcinogenním účinkům řady moleku excise pošlození specifickými glykosylázami po specifickém poškození baží s následným vyříznutím DNA a doplněním pomocí polymeráz a ligáz. Exprese těchto enzymů je u rezistentních buněk pozitivně regulována. Postreplikační reparace umožňuje nápravu vážných poškození DNA. Jestliže nejsou Ted replikací opraveny, způsobují tato poškození replikační blok. Buňky obnovu, yntézuDNA vjinémreplikačnímbodě. Využití inhibitorů reparace DNA může zlepšit terapii. Inhibice specifických enzymů TA polymeráza nebo to im&tlEflllíy liranrorafti ie pnspiva Ei»sniigH:«m ■miftMI^MfflBlkMHfBlMMiiiBl K úspěšnosti ibraňují ad< působ podávání léku - koncentrace a doba a dále morfologické podmínky ■ absorpce, metabolismus, vaskularita a okysličování tkáně. ny přizpůsobením režimu, exiř. ne mechanismy odpovědné za nízkou či vysokou hladinu rezistence. a MDR cells b Tumour stem cell Rgure 2 | Models of tumour d rug resistance, a | In the conventional model of tumour-cell drug resistance, rare cells with genetic alterations that confer multidrug resistance (MDR) form a drug-resistant clone (yellow). Following chemotherapy, these cells survive and proliferate, forming a recurrent tumour that is composed of offspring of the d rug-resistant clone, b | In the cancer-stem-cell model, drug resistance can be mediated by stem cells. In this model, tumours contain a small population of tumour stem cd Is (red) and their differentiated offspring, which are committed to a particular lineage (blue). Following chemotherapy, the committed cells are killed, but the stem cells, which express drug transporters, survive. These cells repopulate the tumour, resulting In a heterogeneous tumour composed of stem cells and committed but variably differentiated offspring, c | In the 'acquired resistance' stem-eel I model, the tumour stem cells (red), which express drug transporters, survive the therapy, whereas the committed but variably differentiated cells are killed. Mutation(s) in the surviving tumour stem cells (yellow) and their descendants (purple) can arise (by mechanisms such as point mutations, gene activation or gene amplification), conferring a drug-resistant phenotype. As in model a, the stem cell with the aquired mutations could be present in the population before therapy, d | In the "intrinsic resistance' model, both the stem cells (yellow) and the variably differentiated cells (purple) are inherently drug resistant, so therapies have little or no effect, resulting in tumour growth. Některé parametry lékové rezistence Host Tumor \ Resistance Factor Determinant Mechanism Intrinsic / (Innate) \ Acquired (Adaptive) Drug concentration Primary target Target-associated pathways; * repair • checkpoints apo ptosis ľigure 1 Some of the parameters involved in drug resistance Determinanty dodání léku do cílového místa Systemic circulation Circulation-tissue interface (for example, blood-brain barrier) Enterocyte Small intestine O Drug □ Metabolite Processes that decrease drug delivery to targets Processes that enhance drug delivery to targets Removal • Metabolism ■ Elimination Delivery Absorption Distribution Other molecules that determine the biological context in which drug-target interactions occur Other molecules with which the drug interacts Variability in the target molecule Target Neonkogenní a onkogenní léková rezistence NON-ONCOGENIC RESISTANCE Oncogenic resistance o — o e Ľfí ü 1 10 100 1000 Drug concentration Fijíurť 1 Nononeogenic and myogenic drug resistance, Conventional^ drug resistance is measured by a drug concentration lliul inhibits eel] growth and survival by a certain percent, For example. IC50 is a concentration that causes 50% decrease in cell survival teg, in drug-sensitive cells (red !ine)T IC50 is I), In nononeogenie {blue line) resistance, the dose cytotoxicity eurve is shifted to the right. An IC5u is increased due to a failure of a drug to inhibit its target. In contrast, in oncogenic resistance. 1C5U is normal but IC^ is not achieved. The killing curve reaches a plateau, because a drug (although Jiormally interacts with its target) does not kill the cells target Figure 2 Two ways to overcome oncogenic resistance, (a) Oncogeneic resistance, inhibitors of apoptosis (block of apoptosis) prevent cell death, even though anticancer drug engage its target (e.g. microtubules, topoisomerases, DNA), (b) Targeting apoptotic pathways downstream of the block, (c) Inhibition of antiapoptotic pathways (releaving a block of apoptosis) restores sensitivity to anticancer drugs Angiogenic factors mild Hypoxia Ami* angiogenic Anli-HIF agent Hypoxia- activated prodrug Deep hypoxia Acidosis, necrosis Figure 6 Antiangiogenic therapy, (a) Targeting endothelial cells causes a HIF-dependent response. Sensing hypoxia, cancer cells stimulate angiogenesis. (b) A combination of antiangiogenic and anti-HIF agents may cause profound anoxia and cancer cell death, which could be further enhanced by anoxia-activated prodrugs Cykloterapie Kinase inhibitor 'modulator Cell survival Growth arrest Reversal of apo pt o sis-resistance y ^ Cyclo-therapeuti agent ľigure 5 Cyclotherapy. Initially, a normal cell is apoptosis prone, whereas a cancer cell is apoptosis reluctant and resistant to cyclotherapeutic agent. A modulator such as a kinase inhibitor reverses resistance of cancer cells (see Figure 2c). Simultaneously, cells with normal cell cycle control are arrested by the same modulator and therefore 'escape' a cyclotherapeutic agent (a) (b) Liposome vector for gene delivery Cancer cells have surface receptors or antigens that bind targeted liposomes Normal cells lack such surface molecules Molecules used for targeting include ligands and antibodies Targeted liposome vector for gene delivery Targeted liposomes can deliver genes selectively to cancer cells Figure 3. (a) Liposomes for gene therapy, (b) Targeting gene delivery via cellular receptors. Využití LAK (lymphokine-activated killer )buněk v protinádorové terapii MOUSE WíTH TUUOR LAX CELLS tl>Tnphokine-activ3ietl killer culls), which were first described in 1980, are another experimental anticancer weap-on_For study In mice (left), production begins with the removal of the spleen from healthy anima is (a\* The lymphocytes in the spleen are isolated (b) and cultured for three days with inter-leuIdn-2 :;;£V CELL ABNORMAL p53 DNA DAMAGED INACTIVE p53 CAUSES SELF-DESTRUCTION -> CELL VIRAL VECTOR TREATMENT DNA DAMAGED TUMOR CELL TUMOR CELLS PROLIFERATE VIRUS INFECTS CELLS VIRUS REPRODUCES IN TUMOR CELLS BUT NOT IN HEALTHY ONES TUMOR CELLS DIE P53 PROTEIN instructs a cell to kill itself if the DNA is damaged by, say, drugs or radiation. But if p53 is abnormal, it may not stop a cell with bad DNA from replicating. One way of treating tumor cells is through viruses genetically engineered so that they reproduce in cells with abnormal p53 but not in healthy cells. In principle, the virus would move unchecked only through tumor cells, killing them. Srovnávací genomova hybndizace a expresní microarray analýza Základní komponenta je fluorescenční poměrná hybridizace Tumor RNA/DNA Ref RNA/DNA cot-1 DNA Clones, oligos QO Chromosomes OOOO OüüOOOOOOOO —II-------------- - Decreased gene copy Increased gene copy In these processes, two nucleic acid samples to be compared are differentially labeled with reagents that fluoresce at different wavelengths. They are then hybridized along with excess, unlabeled repeat rich DNA, to the representation of the genome onto which information is to be mapped. In CGH, the representation may be either metaphase chromosomes or arrays of cloned probes. In expression microarray analysis, the representation may be arrays of cDNA clones or oligonucleotides. Fluorescenční mikrofotografie z výsledků CGH analýzy lidské línie z nádoru prsu MCF7 * ■ • \ _ ' i p > CF7 DNA was labeled green and normal reference DNA was labeled red. The chromosomes were counterstained with DAPI. Thus, regions of weak hybridization appear blue, regions of increased copy number appear green and regions of decreased copy number appear red. Gains Tumor genome PREDIKTIVNI MARKERY Proliferační aktivita a nádorový růst HI IMMIIItgWWl w jSBsSsBMSssSäm&Sl a Růst vyjadřuje celkové zvýšení počtu buněk jako výsledek nárůstu buněk proliferační aktivitou a ztráty buněk apoptózou nebo nekrózou. Proliferační aktivita je výsledkem průchodu buněk bun. cyklem. Mechanismus odpovědný za proliferační aktivitu (P) je rychlost buněčného cyklu, která je v inverzním vztahu ke g vztahu k podílu buněk \i Matematické vyjádření vztahu je P = G/T Vysoká proliferační aktivita je tak důsledkem buď velké růstové frakce nebo král gener. doby nebo obojího. Čas zdvoiení (Td doubling tím Td = T (log 2/log (G+: zdvojení je tedy výsledkem buď krátkého bun. cyklu nebo vysoké růstr frakce nebo obojího. RSl aa PROLIFERACNI MARKERY technikv inkoroorace značenvch analosů nukleotidů do DNA 3H tymidin (autoradiografie) nebo bromdeoxyuridin (BrdU, imunohistochemie) markery buněk v S-fázi bun. cyklu, tj. syntetizujících DNA. Nevýhody: omezené použití in vivo, radioaktivita, dlouhé časy pro vyhodnocení, subjektivní kriteria mitotický index (MI) - nejstarší metoda vyhodnocování prohferace - mikroskopické počítání mitotických figur na preparátech, do budoucna - markery pro FCM. Mitózy však představují jen část proliferujících buněk a délka mitózy je variabilní zejména u aneuploidních nádorů. Míjen částečně koreluje s dalšími markery prohferace procento buněk v S-fázi flow cytometric - fluorescenční barvení DNA - měření fluorescence v suspenzi buněk image (static) cytometry - absorpční barvení (Feulgenova reakce) - měření buněk na sklíčku Histogramy vyjadřující obsah DNA - vyhodnocování % buněk v jednotlivých fázích bun. cyklu - počítačové programy SPF - S-phase fraction - celkem koreluje s dalšími markery (např. MI nebo Ki67) imunohistochemické stanovení antisenů spojených s proliferací PCNA - proliferating cell nuclear antigen - zvýšená exprese u proliferujících buněk -koreluje s ostatními markery, ale ne vždy. Nepříliš vhodný u nádorů, zvýšený i při reparaci DNA. Ki67 - kódovaný genem na chrom. 10 je exprimován v Gl, S a G2 fázi u proliferujících buněk - částečně koreluje s dalšími markery. DNA touoizomeráza II - exprese se rychle zvyšuje při přechodu S a G2 a snižuje se na mwtmnmn^M kódující ribozomální DNA. Přispívají k regulaci syntézy proteinů. Jsou vizualizovány barvením stříbrem - metoda AgNOR. Koreluje s SPF, Ki67 a MI MARKERY BUNEČNÉ SMRTI AI - aDODtickv index Dalsi markery: Molekuly na buněčném povrchu: proliferace: CD71 - receptor pro transferin, receptory pro specifické růstové faktory apoptóza: CD95 (Fas) Změny protoonkogenů a nádorově supresorových genů - fosforylace RB proteinu, p53 (wild type, mutace), antiapoptický bcl-2 a proapotic- Změny cytoskeletoi Markery neproliferujících a klidových buněk: statin Důležité: ► Otázka interpretace a klinické využitelnosti jednotlivých marke: ► Standardizace metod a hodnocení mezi laboratořemi ► Problematika heterogenity nádorů ► Statické vs. dynamické stanovení paramet1 ► Exprese a změny různých onkogenů mono k chemo- a rádioterapii ^ PnQťi'ZPní v^áípmnvŕVh vztalrn ípHnntlívvph rrmrVf ► Predikce odpov« Využití multivariačních analýz pro predikce - analýza základních (principal) component a diskriminační analvza. Á existující informace pro různé typy nádorů (experimentální data I, databáze) empirická zkušenost experimentální data II í doplňování klinických dat í závery í vícerozměrné analýzy sporne výsledky přehodnocení pomocí biomatematických přístupů zobecnění pro jiné situace, jiné typy nádorů, zlepšená predikce a terapie konstrukce modelu experimentální verifikace částečných nesrovnalostí na modelech in vitro