REJSTŘÍK: - 0.1% gelatine, prasečí želatina (porcine skin gelatine) v destilované vodě, MQ kvality, autoklavováno (sterilita + rozpuštění želatiny) - EB, embryoidní tělíska (EB - embryoid bodies), plovoucí trojrozměrné sférické kolonie diferenciujících EC nebo ES buněk - EC buňky, pluripotentní embryonální nádorové (EC - embryonal carcinoma) buňky, kmenové buňky teratokarcinomu ES buňky, pluripotentní embryonální kmenové (ES - embryonic stem) buňky odvozené z vnitřní buněčné masy blastocysty - DMSO, dimethylsulfoxide, organické rozpouštědlo - ITS médium, serum-free medium, DMEM : F12 media (1 : 1) + ITS supplement (insulin, transferin, selen) ) + antibiotika (penicilin/streptomycin) - kompletní DMEM médium, DMEM + 10% séra (telecí fetální) + antibiotika (penicilin/streptomycin) + 0.05 mM b-merkaptoethanol - MTT (1-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-3,5-diphenylformazan), MTT stock solution, 2.5 mg MTT na 1 ml PBS - MTT extrakční pufr, 10% Triton X-100 + 0.1 M HCl - PBS, fosfátový pufr pro tkáňové kultury, 8 g NaCl + 0.2 g KCl + 0.2 g KH[2]PO[4] + 2.16 g Na[2]HPO[4].7H[2]O, (2.88 g Na[2]HPO[4].12H[2]O) na 1L MQ vody, pH 7.4 - RA, kyselina retinová - all-trans retinoic acid, zásobní roztok 5-15 mM v EtOH, pracovní zásobní roztok 50-100 mM v PBS - SDS lyzační pufr, 1% SDS, 100mM Tris pH 6.8, 10% glycerol - TC plastik, plastik pro tkáňové kultury (TC – tissue culture) - TSA, trichostatin A, inhibitor acetyltransferáz, protinádorové léčivo A. Trypsinizace adherentních buněk = převod adherentních buněk do suspenze Většinu adherentních buněk lze převézt do suspenze tzv. trypsinizací. 1) odsaj růstové médium a opláchni buňky PBS (stačí stejný objem jako byl růstového média) 2) přidej pracovní roztok trypsin (0.25 %) / EDTA tak, aby udělal tenkou vrstvu na dně kultivační misky (pro misku o průměru 60 mm 350 – 500 ml, pro misku o průměru 100 mm 700 – 1000 ml). 3) můžeš dát tuto misku do termostatu a nebo při R.T. přímo pozorovat uvolňování buněk od podkladu. Buňky by měly v trypsinu být tak 3 – 5 minut. 4) k uvolněným buňkám přidej kompletní růstové médium obsahující sérum (absolutní objem séra tak 1 : 1 k objemu roztoku trypsin / EDTA) nebo inhibitor trypsinu. 5) pipetou buňky jemně rozsuspenduj na homogení populaci, spočítej je a použij do experimentu nebo pasážuj v požadovaném množství. B. Důkaz pleiotropního působení kyseliny retinové (RA) Model: Diferenciace EC buněk linie P19 do buněk primitivního entodermu a buněk neuroektodermu působením RA. Teorie: RA je silným indukrotem diferenciace buněk EC P19. V adherentní, jednovrstevné kultuře (monolayer) buněk P19, v závislosti na přítomnosti sérových faktorů/séra, RA (0.1-1 mM) indukuje vznik buněk primitivního entodermu a neuroektodermu. V přítomnosti séra vznikají buňky primitivního entodermu, za jeho nepřítomnosti buňky neurální. Postup: 1) připrav si dvě želatinou potažené petriho misky pro TC (průměr 60 mm, plocha 20 cm^2). 2) na jednu tuto TC misku vysej 5000 (PE) a na druhou (NE) 10 000 buněk P19 na cm^2 v kompletním DMEM médiu, finální objem 5 ml. 3) 2-3 hodiny po vyseti vyměň kompletní DMEM na misce „NE“ za ITS médium. 4) do obou misek přidej RA do finální koncentrace 0.2 mM. 5) po 2 dnech kultivace u obou misek vyměň médium za čerstvé. Miska „PE“ kompletní DMEM, miska „NE“ ITS, v obou případech již bez RA. 6) po dalších dvou či více dnech pozoruj morfologické změny případně aplikuj detekci nekterého ze specifických markerů pro daný buněčný typ. Závěr: Na misce „PE“ by měly vznikat buňky primitivního entodermu (ploché buňky pozitivní na cytokeratin Endo A) a na misce „NE“ buńky neurální (neurony + glie, charakteristická morfologie a experese specifických proteinů, N-cadherin, neuron specifický III b-tubulin, GAP-43, N-CAM, GFAP,...). Literatura: http://www.biomed.cas.cz/physiolres/pdf/2005/54_115.pdf C. Technika embryoidních tělísek - příprava kardiomyocytů Model: Diferenciace EC buněk linie P19 do kardiomyocitů technikou embryoidních tělísek v přítomnosti DMSO Teorie: Zabráníme-li EC (nebo ES) buňkám adherovat k podkladu, začnou vytvářet tzv. embryoidní tělíska, EB. Buňky obsažené v EB diferencují různými směry, prakticky do všech třech zárodečných listů. V hodnými doplňky růstového média lze tuto diferenciaci více specifikovat. EB v přítomnosti DMSO diferencují zejména směrem do buněk mezodermu a posléze kardiomyocytů. Postup: 1) připrav si suzpenzi buněk P19 o hustotě 3 – 5 buněk v jednom ml kompletního DMEM s 1 % DMSO 2) 10 ml této suspenze vysej na baktriologickou plastovou petriho misku (průměr 90-100 mm) 3) ze stejné suspenze jako v bodě „2“, nanes kapky o objemu 35 ml na vnitřní stranu víčka petriho misky pro TC (průměr 90-100 mm), víčko pak přiklop zpět na misku do které jsi dal/dala 10-15 ml PBS 4) po 4 dnech kultivace zkontroluj vytvořená EB, a přenes je na nové misky pro TC (radši potažené želatinou) do kompletního DMEM již bez DMSO. 5) po dalších 3-5 dnech, pozoruj objevení kardiomyocytů v podobě pravidelně tepajících koloniích na dně misky Závěr: Jak na bakteriologické misce, tak v kapkách by měly vzniknout EB. Po přenesení na TC misku s adhezivním povrchem, EB adherují na její dno a dávají vznik koloniím, které po 7 a více dnech celkové kultivace začínají pravidelně tepat v důsledku přítomnosti diferencovaných kardiomyocytů. Přítomnost kardiomyocytů lze dále potvrdi detekcí specifických proteinů (Sarkomerický alfa-aktin, Troponin I). Literatura: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T14-48KD1W0-8&_coverDate=05%2F01%2F2003&_alid=404330618&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=4880&_sort=d&view=c&_acct=C000045159&_version=1&_urlVersion=0&_userid=835458&md5=b8f05aa97394b880a1c385e59325484b D. Detekce proliferační aktivity adherentích buněk Model: Analýza růstu EC buněk linie P19 po působení RA (0.1 a 1 mM) a TSA (10, 50 a 100 nM). Teorie: Stanovené růstové aktivity buněčné populace je možno provést nejen sledováním počtu živých buněk v takové populaci, ale také analýzou aktivity některé z jejich metabolických drah a nebo jako celkového množství proteinů, které tato populace obsahuje. Postup: 1) na 12 (1 jamka = 3.6 cm^2) a 96 (1 jamka = 0.4 cm^2) jamkovou destičku vysej buňky P19 v kompletním DMEM médiu o hustotě 5000 buněk na cm^2. Počítej stím, že na 12 jamkové destičce budou duplikáty a na 96 jamkové triplikáty. V případě 96 jamkové destičky také buňky nevysévej do okrajových jamek, ale do středních a ty okolo naplň PBS. Finání objem pro 12 jamkovou desku je 2 ml, a pro 96 jamkovou 200 ml média v jedné jamce. 2) ovlivnění buněk na 96 jamkové desce proveď tak, že buňky vysej v objemu 100 ml a poté se k nim přidej dalších 100 ml média s naředěnými drugs o dvojnásobné koncentraci než je požadovaná finálně, v jamce tak bude celkem 200 ml média o požadované koncentraci drugs. 3) k buňkám na 12 jamkové desce přidej požadovaná drugs o žádané koncentraci přímo ze zásobního roztoku, případně po jeho naředění, aby se přidávaný objem pohyboval v rozsahu 2 - 20 ml, kdy ho na 2 ml celkového objemu média v jamce můžema považovat za zanedbatelný*. 4) po 2 dnech kultivace 2x PBS opláchni buňky na 12 jamkové desce a zlyzuj je v SDS lyzačním pufru (150-300 ml, podle buněčné denzity u nejvíce rostoucí jamky). 5) pro optimální homogenizaci vzorku je tento lyzát vhodné sonikovat. 6) pomocí DC Protein Assay kitu fy Bio-Rad změř koncentraci proteinů v lyzátech. 7) u 96 jamkové destičky po 2 dnech kultivace k buňkám přidej do každé jamky 20 ml MTT roztoku a desku vrat zpět do termostatu (teď bez víčka!!!!, na sterilitě již nezáleží). 8) po 2 hodinách kultivace v termostatu, zkontroluj vznik barevného formazanu v buňkách, pokud se ti zdá málo, nech kultivovat ještě 1 hodinu. 9) odstraň médium z jamek 96 jamkové desky (nejlépe vyklepnutím do umyvadla a pak na filtrační papír) 10) poté se do každé jamky napipetuje 50 – 100 ml (v závislosti na množství vytvořeného formazanu) MTT extrakčního pufru a za mírného třepaní se barevný formazan nechá extrahovat. 11) po vyextrahování formazanu se jeho absorbance změří na ELISA readeru při vlnové délce 570 nm. * V případě že rozpouštedlo drugs je biologicky aktivní, je nezbytné i je samotné přidat do kontrolních jamek. Závěr: Populace pomaleji rostoucích buněk obsahuje méně proteinů (12 jamková deska) a pomaleji rostoucí buňky mají i menší metabolickou aktivitu a je jich samozřejmě také méně (96 jamková deska). Metabolická aktivita je zde měřena jako schopnost oxidačně-redukčních systémů buňky měnit rozpustnou a žlutou tetrazoliovou sůl (zde MTT) na nerozpustný a fialově zbarvený formazan, akumulovaný uvnitř buněk. Je dobré si uvědomit, že stanovení celkového proteinu jako růstového parametru není vhodné u buněk tvořících nadměrné množství extracelulární matrix, např. chondrocyty. MTT test zase není vhodný v případě, kdy testovaná drugs jsou sama o sobě silnými oxidačně-redukčními činidly. Literatura: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T2Y-3Y6PGJS-X&_coverDate=12%2F31%2F1995&_alid=405645818&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_qd=1&_cdi=4931&_sort=d&view=c&_acct=C000045159&_version=1&_urlVersion=0&_userid=835458&md5=d34ccb42e71a6218287be730f3635489 E. Detekce aktivity alaklické fosfatázy – znak diferenciačního stavu buňky Model: viz výše. Teorie: Detekce aktivity alkalické fosfatázy (AP) může v mnoha buněčných systémech sloužit k posouzení diferencoavného stavu buněk. V případě buněk EC P19, nediferencované buňky vykazují vysokou aktivitu tohoto enzyma, a to zejména jeho isoformy GCAP (Germ cell AP), označované také jako embryonální AP. Detekci lze provézt jak kvalitativně, tak kvantitativně. Zde se zaměříme na semi-kvantitativní stanovení přímo v kultuře. Postup: 1) buňky se vysejí na vhodný plastik, např, 2ml misky nebo 6-12 jamkovou desku pro TC v densitě 5000 buněk na cm^2 v kompletním DMEM. 2) po uchycení buněk (víc jak 2-3 hodiny) se provedou příslušné experimentální zásahy, např. indukce diferenciace RA, odstraněním růstových faktorů a pod. 3) před vlastním stanovením, se z buněk odstraní médium a buňky se zafixují 2-4 % formaldehydem (v PBS) po dobu 5-15 minut (pro delší fixaci je vhodné fixovat při 4^oC). 4) po fixaci se buňky 2x opláchnou reakčním pufrem (pufr, v kterém bude probíhat i stanovení aktivity AP) 5) stanovení se pak provede podle návodu, např. http://www.vectorlabs.com/products.details.asp?prodID=41&locID=662463 6) vyhodnocení se provede srovnáním rozdílů v aktivitě AP pomocí mikroskopu Závěr: U diferencovaných buněk by mělo dojít k poklesu aktivity AP, zejména v důsledku snížení její exprese. Problémem však může být objevení se nových isoform AP, indukovaných diferenciací. Toto lze řešit např. použitím specifických protilátek k jednotlivým isoformám AP, případně změnami fyzikálních podmínek před vlastní detekcí (některé isoformy AP jsou termolabilní). Pro přesnou kvantifikaci je samozřejmě vhodné použití jiné, čistě kvantitativní metody, např.: http://www.sciencedirect.com/science?_ob=ArticleURL&_udi=B6T68-414N3D8-K&_user=835458&_coverDate=09%2F30%2F2000&_rdoc=1&_fmt=&_orig=search&_sort=d&view=c&_acct=C000045159&_version=1&_urlVersion=0&_userid=835458&md5=2e85338e04e5a50c324d5974264bdb1e