ZÁKLADNÍ A ROZŠÍŘENÁ SADA TESTŮ ZÁKLADNÍ (skríninková) sada testů A-1A. Test na reverzní mutace na Salmonella typhimurium (ev. A-1B. fluktuační verze) A-2. SOS chromotest na Escherichia coli B-1. Test na chromozomové aberace in vitro u savců B-2. Mikrojaderný test in vivo na savcích B-3. Test na genové mutace in vitro na savčích buněčných kulturách B-4. Test na recesivně letální mutace vázané na pohlaví u Drosophila melanogaster C-2. Test na genové mutace na Tradescantia V případě testů chemických látek farmaceutických produktů potravinových aditiv obalových materiálů kosmetických přípravků aditiv krmiv pesticidů použít: A-1A, B-1, B-2, B-3 V případě testů prostředí in situ vzorků prostředí provozoven záření použít: A-2, B-1, B-2, B-4, C-2 ROZŠÍŘENÁ (doplňková) sada testů B-5. Test na sesterské chromatidové výměny in vitro (SCE) B-6. Test na neprogramovanou syntézu DNA in vitro (USD) B-7. Test na somatické mutace a rekombinace na Drosophila melanogaster (SMART) B-8. Test na mutace v pohlavních buňkách B-9. Test na karcinogenitu - dlouhodobá studie na hlodavcích C-1. Test na chromozomové aberace a sesterské chromatidové výměny u Vicia faba C-3. Test na letální embryonální mutace u na Arabidopsis thaliana D Molekulárně-genetické testy ve specifickém lokuse (transgenní organizmy, FISH, PCR, SSCP, DGGE, RFLP) V případě testů chemických látek farmaceutických produktů potravinových aditiv obalových materiálů kosmetických přípravků aditiv krmiv pesticidů použít: B-5, B-6, B-7, B-8, B-9, D V případě testů prostředí in situ vzorků prostředí provozoven záření použít: B-5, B-6, B-7, B-8, C-1, C-3, D Popis baterií testů doporučených k testování genotoxicity u jednotlivých substancí A. Nové chemické látky Základní hladina: produkce 0,1-1 tuna/rok, povinný 1 test A-1 Test na reverzní mutace na Salmonella typhimurium nebo A-2 SOS chromotest na Escherichia coli V případě pozitivního výsledku pokračovat jako v hladině 0. Hladina 0: produkce 1-10 tun/rok, povinné 2 testy 1. viz. základní hladina 2. B-2 Mikrojaderný test in vivo na savcích nebo B-1 Test na chromozomové aberace in vitro u savců V případě pozitivního výsledku pokračovat jako v hladině 1. Hladina 1: produkce 10-1000 tun/rok, povinné 4 testy 1. a 2. viz. hladina 0 3. B-3 Genové mutace in vitro na savčích buněčných kulturách 4. B-5 Test na sesterské chromatidové výměny in vitro nebo B-6 Test na neprogramovanou syntézu DNA in vitro nebo B-8 Test na mutace v pohlavních buňkách D Molekulárně-genetické testy ve specifickém lokuse V případě pozitivního výsledku pokračovat testem na karcinogenitu. Hladina 2: produkce více jak 1000 tun/rok, povinné 4 testy a test na karcinogenitu 1. až 4. viz. hladina 1 B-9 Test na karcinogenitu-dlouhodobá studie na hlodavcích Rozhodnutí: A. Pozitivní test na karcinogenitu – zákaz výroby nebo zvýšená ochrana před stykem s člověkem B. Pozitivní výsledek u A-1 (A-2) a současně B-2 (B-1) a současně B-5 (B-6)(D), negativní výsledek testu na karcinogenitu – zvýšená ochrana před stykem s člověkem C. Pozitivní výsledek u A-1 (A-2) a současně B-2 (B-1), v ostatních testech nemutagenní a nekarcinogenní – zamezit běžnému styku s člověkem B. Farmaceutické produkty, potravinové aditiva, obalové materiály, kosmetické přípravky, aditiva krmiv a pesticidy Společná baterie testů sestává z následujících úrovní: Genové mutace u prokaryot: A-1 Test na reverzní mutace na Salmonella typhimurium A-2 SOS chromotest na Escherichia coli Chromozomové aberace: B-1 Test na chromozomové aberace in vitro u savců B-2 Mikrojaderný test in vivo na savcích Genové mutace u eukaryot: B-3 Genové mutace in vitro na savčích buněčných kulturách Speciální efekty: B-5 Test na sesterské chromatidové výměny in vitro B-6 Test na neprogramovanou syntézu DNA in vitro B-8 Test na mutace v pohlavních buňkách B-9 Test na karcinogenitu - dlouhodobá studie u savců D Molekulárně-genetické testy ve specifickém lokuse Farmaceutické výrobky a potravinové aditiva: Povinné použití alespoň jednoho testu na všech 4 úrovních. Obalové materiály a aditiva krmiv: Povinné použití alespoň jednoho testu na prvních 3 úrovních. Kosmetické přípravky: Povinné použití alespoň jednoho testu na prvních 2 úrovních. Pesticidy (proteiny produkované rostlinami, biocidy): povinné použití vždy jednoho testu z prvních 3 úrovní. C. Sledování prostředí in situ, vzorky prostředí, testování provozoven s nebezpečnými látkami a záření O použití jednotlivých testů následující baterie rozhoduje také znalost charakteru a množství výskytu nebezpečných látek ve sledované lokalitě. Genové mutace u prokaryot: A-2 SOS chromotest na Escherichia coli Chromozomové aberace: B-1 Test na chromozomové aberace in vitro u savců nebo B-2 Mikrojaderný test in vivo na savcích Genové mutace u eukaryot: B-3 Genové mutace in vitro na savčích buněčných kulturách B-4 Test na recesívně letální mutace vázané na pohlaví u D. melanogaster C-2 Test na genové mutace u Tradescantia Speciální efekty: B-5 Test na sesterské chromatidové výměny in vitro B-6 Test na neprogramovanou syntézu DNA in vitro B-7 Test na somatické mutace a rekombinace u D. melanogaster B-8 Test na mutace v pohlavních buňkách C-1 Test na chromozomové aberace a sesterské chromatidové výměny u Vicia faba C-3 Test na letální embryonální mutace u Arabidopsis thaliana D Molekulárně-genetické testy ve specifickém lokuse Rozhodnutí o dalším nakládání s testovanou substancí, LEGISLATIVNÍ NAŘÍZENÍ Rozhodnutí o použití, omezení či zákazu používání testované substance se řídí dle následujících kritérií: Nové chemické látky nebo látky, které nebyly na genotoxicitu testovány: řídí se Zákonem o chemických látkách a chemických přípravcích a o změně některých dalších zákonů 157/1998 a vyhlášky 250/98 registrujícím chemické látky, 251/1998 kterou se stanoví metody pro zjišťování toxicity chemických látek a přípravků, 299/98 o fyzikálně-chemických vlastnostech chemických látek, 301 a 302/98, kterými se stanoví seznam chemických látek a chemických přípravků, jejichž výroba, uvádění na trh a používání je omezeno, 306/98 o postupu hodnocení rizika nebezpečných chemických látek pro životní prostředí § 4. EKOTOXICITA 4.1 Toxicita pro ryby 4.2 Toxicita pro dafnie a ostatní vodní bezobratlé 4.3 Toxicita pro řasy 4.4 Toxicita pro bakterie 4.5 Toxicita pro suchozemské organismy 4.6 Toxicita pro půdní organismy dále 384/2001 o nakládání s polychlorovanými bifenyly (PCB), polychlorovanými terfenyly, monometyltetrachlordifenylmetanem, monometyldichlordifenylmetanem, monometyldibromdifenylmetanem a veškerými směsmi obsahujícími kteroukoliv z těchto látek v koncentraci větší než 50 mg/kg (o nakládání s PCB), 408/2000 o ochraně zdraví před neionizujícím zářením a zákonem o odpadech 185/2001. Farmaceutické přípravky: řídí se dle Commission Directive 91/507/EEC, 87/18/EEC, 88/320/EEC, guideleine III/3824/92, a podle The European Agency for the Evaluation of Medicinal Products CPMP/ICH/140/ 95, CPMP/ICH/141/ 95, CPMP/ICH/ 299/95, CPMP/ICH/366/96. Potravinové aditiva: řídí se dle zákona 110/1997 a vyhlášky 273/97 o potravinových aditivech nově i 54/5002, 292/97 o balené vodě, 294/97 o mikroorganizmech v potravinách, 295/97 o hygieně potravin, 298/97 o chemických látkách v potravinách, 322/99 o residuích v potravinách, 374/2000 o GMO potravinách, 379/2000 o pitné vodě a 38/2001 o obalových materiálech potravin a 53/2002 o doplňcích potravin. Zákon je tvořen dle doporučení JECFA (Join Experts Commission on Food Aditives) pro země EU. Obalové materiály: řídí se dle hygienických směrnic zákona 20/1966 o péči a zdraví lidu, svazek 32/1970 a vyhláškou 38/2001 o obalových materiálech potravin. Aditiva v krmivech: řídí se zákonem o krmivech 160/1996, vyhláškou 298/98 o veterinárních léčivech a biologicky aktivních látkách. Kosmetické výrobky: řídí se dle hygienických směrnic zákona 20/1966 o péči a zdraví lidu, svazku 32/1970 a vyhlášky 26/2001. Pesticidy: řídí se zákonem 147/1996 Sb. o podmínkách registrace nových látek na ochranu rostlin , prováděcího předpisu vyhlášky 84/1997 Sb., přílohy 1. Zákon je tvořen dle doporučení Commission Directive EU 91/414/EEC v požadavcích I. A II. Sledování lokalit in situ, vzorky prostředí, pracovní místa a provozovny s toxickými chemickými látkami, záření: V případě pozitivních výsledků testů musí vycházet doporučení k regulaci a omezení zdroje znečištění a musí následovat epidemiologická studie u lidí. Ta se řídí dle hygienických směrnic zákona 20/1966 o péči a zdraví lidu, svazek 32/1970, 89/2001 o biologických expozičních testech a vyhláškou 178/2001 o ochraně zdraví při pracovní činnosti. INTERPRETACE VÝSLEDKŮ Kriteria pro klasifikaci mutagenů Kategorie 1. Substance známé jako mutageny u člověka, kde existuje dostatečné množství údajů pro potvrzení kausálního vztahu mezi lidskou expozicí a dědičným genetickým poškozením. Je požadován důkaz z epidemiologických studií u lidí. Kategorie 2. Substance, které mohou být pokládány za mutagenní u člověka, kde existuje dostatečné množství údajů k potvrzení předpokladu, že expozice lidí sledované substanci může mít za následek dědičné genetické poškození. Všeobecně lze substanci do této kategorie zařadit na základě přiměřených studií u živočichů a dalších relevantních informací. Kategorie 3. Substance, které jsou příčinou možných mutagenních vlivů na člověka, ale o kterých nejsou věryhodné informace demonstrující dědičné genetické poškození. Kriteria pro klasifikaci karcinogenů Skupina 1. Substance potvrzené jako karcinogeny u člověka. Skupina 2A. Substance pravděpodobně karcinogenní pro člověka Skupina 2B. Možné karcinogeny u člověka. V každé ze skupiny 1., 2A a 2B je nutné, aby 80-90% karcinogenů bylo identifikováno jako genotoxické u krátkodobých testů. Skupina 3. Substance, o kterých existuje omezené množství údajů o karcinogenitě u zvířat. Skupina negenotoxicky působících karcinogenů. Negativní ve standardních testech genotoxicity (nereaguje přímo s DNA), ale působící negenotoxickými mechanizmy karcinogeneze. Korelace výsledků krátkodobých testů genotoxicity s karcinogenitou Na základě výsledků krátkodobých testů genotoxicity lze predikovat možný karcinogenní účinek sledované substance. Odhady takového stanovení se liší od 90% k 54% (Ashby, 1985; Tennant, 1987; Zeiger, 1987; Carere a kol., 1995). Jako rychlý systém pro odhad karcinogenity jsou doporučeny transgenní organismy (Yamamoto a kol., 1997). PŘÍKLADY POUŽÍVANÝCH BATERIÍ TESTŮ GENOTOXICITY V RŮZNÝCH ZEMÍCH UK (1989): etapa 1. 2 testy in vitro: O/ genové mutace u bakterií O/ klastogenicita na savčích kulturách etapa 2 (u látek pozitivních v etapě 1). 2 testy na somatické tkáni: O/ chromozomové aberace v kostní dřeni savců O/ DNA poškození v jiných orgánech (játra) etapa 3 (v případě, že je potvrzeno riziko tvorby gametických mutací). Následuje kaskáda 3 testů na gametické mutace: O/ dominantně letální test ve spermatogoniích, dále v případě pozitivity O/ test na reciproké translokace u myší nebo na nondisjunkce (10-ti denní), dále v případě pozitivity O/ kvantitativní test na dědičné efekty u myší (dědičné translokace, specifické lokusy) Itálie (1989): etapa 1. 4 testy in vitro: O/ genové mutace u bakterií O/ genové mutace u eukaryont O/ chromozomové aberace u savčích kultur O/ DNA poškození/reparační testy (USD, SCE) etapa 2. (u látek pozitivních v etapě 1): O/ in vivo test na somatické a/nebo gametické mutace etapa 3. (v případě, že je potvrzeno riziko tvorby gametických mutací). Kaskáda 3 testů na gametické mutace: O/ kvantitativní test na dědičné efekty (dědičné translokace, specifické lokusy) V případě malého rizika expozice chemickou látkou jsou doporučeny 2 in vitro testy: O/ genové mutace u bakterií O/ chromozomové aberace v savčích buňkách U.S. EPA (1990): Iniciační baterie požadovaná pro testování mutagenity etapa 1.: O/ test na reverzní mutace u Salmonella etapa 2.: O/ test na genové mutace u myších buněčných kultur (lymfatické buňky L5178Y, nebo CHO AS52 nebo V79) O/ in vitro test na chromozomové aberace u savců etapa 3.: O/ in vivo test na chromozomální efekty (chromozomové aberace v kostní dřeni savců nebo test na mikrojádra) V případě potvrzení výsledků iniciační baterie se dále testuje specifičtějšími testy: O/ kvantitativní a/nebo kvalitativní testy na potvrzení rizika dědičných mutací O/ dlouhodobá studie karcinogenity Japonsko (1993): etapa 1.: O/ genové mutace u bakterií etapa 2. (u látek pozitivních v etapě 1.): O/ in vivo test na chromozomové aberace V případě pozitivity se konstatuje, že chemikálie je nebezpečná pro člověka.