TEORIE A ZADÁNÍ ÚLOH D NUKLEOVÉ KYSELINY Nukleové baze Nukleosidy Primární struktura nukleových kyselin Metody stanovení sekvence nukleových kyselin: Enzymy hydrolyzující nukleové kyseliny mohou být specifické na DNA, RNA, nebo bez specifity Fosfomonoesterázy: hydrolyzují teminální fosfátovou skupinu Fosfodiesterázy: hydrolyzují fosfodiesterovou vazbu: exonukleázy (5´- exonukleázy uvolňují 3´P nukleosidy, 3´- exonukleázy uvolňují 5´P nukleosidy) endonukleázy uvolňují oligonukleotidy, jsou obvykle substrátově specifické (desoxyribonukleáza, ribonukleáza) Polynukleotidkináza: Fosforyluje volnou 5´OH skupinu pentózy pomocí ATP Maxam-Gilbertova metoda sekvenace nukleových kyselin.: 1. Označení konce nukleové kyseliny pomocí ATP (^32P) 2. Specifická chemická hydrolýza v místě: G: působením DMS za tepla G + A: působením kyseliny a DMS C: působením hydrazinu v prostředí 5 M NaCl C + T: působením hydrazinu 3. Elekroforéza získaných fragmenů za denaturačních podmínek (rychlost migrace je nepřímo úměrná počtu nukleotidů) 4. Autoradiografie gelu Sekundární struktura DNA Základní strukturou DNA je dvojitá šroubovice stabilizovaná vodíkovými vazbami mezi A-T a G-C. Dvojitá šroubovice obsahuje 10 pb na jednu otáčku a vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm. (méně běžná A-šroubovice DNA obsahuje 11 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousední bazemi je 0,23 nm. Z-šroubovice DNA obsahuje 12 pb/otáčka a vzdálenost mezi sousedními pb je 0,38 nm). Genetický kód mRNA prokaryontů: 1. Napište vzorce adeninu, nukleosidu a nukleotidu od něho odvozeného 2. Roztok obsahující AMP a GMP měl absorbanci A[260] = 0.652 a A[280] = 0.284, vypočítejte koncentraci AMP a GMP v roztoku, jestliže pro AMP je e při 260 = 15.4 x 10^3 M^-1.cm^-1, e při 280 = 2.5 x 10^3 M^-1.cm^-1. Pro GMP e při 260= 11.7 x 10^3 M^-1.cm^-1, e při 280 = 7.7 x 10^3 M ^-1.cm^-1. 3. Napište úplnou strukturu ribodinukleotidu a desoxyribodinukleotidu složeného z A a C. 4. Vypočítejte průměrnou molekulovou hmotnost jednoho nukleotidového zbytku DNA a RNA, za předpokladu, že baze jsou přítomny v ekvimolárních koncentracích. Nezapomeňte na kondenzaci vody při vytvoření esterové vazby! (Molekulové hmotnosti složek: A = 135, G = 151, C = 111, U = 112, T = 126, ribóza 150, kys. fosforečná = 98). 5. Schematické znázornění sekvence RNA (zapsáno od volného 3' konce k 5' konci) je následující: UpCpUpApGpAp Napište produkty hydrolýzy této RNA pomocí následujících enzymů: a) fosfomonoesteráza b) fosfodiesteráza hadího jedu (3´- exonukleáza) c) fosfodiesteráza ze sleziny (5´- exonukleáza) d) ribonukleáza T1 (hydrolýza v místě G, vznik 3´P oligonukleotidu) e) ribonukleáza U2 (hydrolýza v místě A nebo G, vznik 3´P oligonukleotidu) 6. Oligonukleotid pocházející z DNA má následující sekvenci (zapsáno od volného 5' konce k 3' konci): pApCpTpTpApG 5´ terminální nukleotid byl označen ^32P. Jaké oligonukleotidy získáme po působení fosfodiesterázy hadího jedu (viz výše). Které z nich budou značeny ^32P? Které oligonukleotidy získáme hydrolýzou pomocí desoxyribonukleázy II a které z nich budou značeny ^32P (desoxyribonukleáza II je endonukleáza uvolňující 3´P oligonukleotidy). 7. Oligoribonukleotid X je složen z následujících bazí: 2A, 2C, U, G. a) po působení fosfodiesterázy z hadího jedu se po krátké době uvolní pC. b) hydrolýzou pomocí pankreatické ribonukleázy získánme C, dinukleotid obsahující A a C a dále trinukleotid obsahující A, G a U. (penkreatická ribonukleáza je endonukleáza a působí v místě C a U za vzniku 3´P oligonukleotidů). c) hydrolýzou pomocí ribonukleázy T2 (hydrolýza v místě A za vzniku 3´P oligonukleotidů) získáme pAp, dinukleotid obsahující U a C a trinukleotid obsahující A, G a C. Určete sekvenci oligoribonukleotidu 8. Udejte sekvenci oligodesoxyribonukleotidu stanovovanou Maxam-Gilbertovou metodou. Po autoradiografii byl získán následující obraz: G + A G C + T C start 9. Při replikaci řetězce DNA --AGCGTAG-- byl vytvořen komplementární řetězec o jaké sekvenci ? Jaká bude sekvence RNA vytvořená při transkripci. 10. Napište sekvenci komplementární k uvedenému řetězci DNA, vyhledejte úseky obsahující palindrom. a/ GATCAA, b/ TGGAAC, c/ GAATTC, d/ ACGCGT, e/ CGGCCG, f/ TACCAT 11. Vypočítejte molekulovou hmotnost jednoho průměrného páru bazí (molekulová hmotnost A = 135, T = 126, G = 151, C = 111, desoxyribóza 134, kys. fosforečná 98. Nezapomeňte na odštěpení vody při tvorbě esterové vazby) Jaká je molekulová hmotnost molekuly DNA o délce 1 mm v Da a hmotnost v gramech? 12. Jaterní buňka krysy obsahuje 10^-11 g DNA. Tato DNA je rovnoměrně rozdělena do 42 chromosomů buňky. a) Jaká je molekulová hmotnost DNA (1 chromosom obsahuje jednu molekulu DNA). b) Vypočítejte počet párů bazí DNA obsažené v jednom chromosomu a jeho délku (vzdálenost mezi dvěma následujícími pb je 0,34 nm, molekulová hmotnost jednoho páru bazí je v průměru 617,5). 13. Molární složení guaninu + cytosinu v DNA určité bakterie je 67,2%. Jaký je poměr mezi purinovými a pyrimidinovými bazemi? Jaké je molární složení v procentech jednotlivých bazí této DNA. 14. Při analýze byla zjištěna změna v aminokyselinovém složení bílkoviny, jejíž gen byl mutován. Vyberte z následujících změn ty případy, které jsou výsledkem mutace provedené změnou jedné baze. Phe ® Leu Lys ® Ala Ala ® Thr Phe ® Lys Ile ® Leu His ® Glu Pro ® Ser 15. DNA fága lambda vzniklá deleční mutací má délku 13, 6 mm namísto 16, 49 mm. a) Vypočítejte, kolik pb tomuto mutantovi chybí b) Jaký je rozdíl v molekulové hmostnosti a hmotnosti v gramech obou DNA c) Část, u které byla provedena delece odpovídá sekvenci kódující protein P. Jaká je molekulová hmotnost tohoto proteinu. Průměrná molekulová hmotnost aminokyseliny je 140. 16. Směs nukleosidtrifosfátů značených ^32P na g-fosfátu byla inkubována s RNApolymerázou: Po určité době byla zjištěna inkorporace 100 molekul značeného fosfátu do výsledného produktu. Tentýž pokus byl proveden se směsí nukleosidtrifosfátů značených na fosfátu a. Byla zjištěna inkorporace 3.10^4 molekul fosfátu do značeného produktu. Jaký počet řetězců RNA byl syntezován a jaká je jejich průměrná délka? 17. Aminokyselinová sekvence C-terminální oblasti bílkoviny a odpovídající kódující sekvence DNA jsou následující: Phe-Glu-Ile-Leu-Glu-Arg-Arg TTT GAG ATT CTG GAG CGG CGG Popište mutace, které by mohly vnést do této sekvence restrikční místo TT/CGAA a jiné restrikční místo A/GATCT a to za podmínky, že nedojde ke změně sekvence aminokyselin ve vzniklém peptidu. 18. DNA bakteriofága má následující složení bazí: C 19%, A 25%, T 33% a G 23%. a) Co je na této DNA neobvyklé a čím se dá její struktura charakterizovat b) Tato DNA byla použita jako matrice in vitro při reakci katalyzované DNA polymerázou. Jaké bude složení bazí této nově syntezované DNA? c) pokud by množství nasyntezované DNA bylo stejné jako je množství matrice, jaké je celkové složení bazí (to je DNA matrice + DNA syntezované in vitro) d) mRNA syntezovaná jakožto odpověď na infekci fágem má následující složení: C 18%, A 25% U 34% G 23%. Který řetězec DNA byl použit pro syntézu RNA? 19. Byla provedena syntéza polynukleotidu mRNA in vitro za použití 90% UTP a 10% CTP. Tyto polymerní molekuly byly poté použity pro syntézu polypeptidu za přítomnosti všech 20 t-RNA. Syntezované polypeptidy byly hydrolyzovány a jejich celkové aminokyselinové složení bylo následující: 81% Phe, 1% Pro, 9% Ser, 9% Leu. Vypočítejte frekvenci všech kodonů a zdůvodněte odpovídající aminokyselinové složení polypeptidů. 20. Při pokusu byla enzymově připravena glutaminyl-tRNA značená na glutaminu. Poté byla tato látka chemicky desaminována za vzniku glutamyl-tRNA. Tato tRNA byla přidána do bezbuněčné směsi připravené z E. coli a zbavené mRNA. Ke směsi byl přidán uměle připravený polymer obsahující ekvimolární koncentraci G a A. Kolik procent glutamátu bude obsahovat syntezovaný polypeptid? 21. Při stanovení primární struktury enzymu bylo zjištěno, že se skládá z 250 aminokyselin. Jaký je minimální počet nukleotidů strukturálního genu tohoto enzymu? Při bodové mutaci tohoto strukturálního genu došlo k náhradě jednoho serinu glutamátem. Tento fakt se projevil ztrátou enzymové aktivity. Co z tohoto faktu lze vyvodit? G REDOXNÍ REAKCE Základní vztahy: [ox] + e‑ U [red] redoxní potenciál E (definován při pH 7.0) E = E[o ] + RT ln [ox] nF [red] stand. aktuální redox pot. koncentrace složek F = 96500 C.mol^‑1 R= 8.31 J.deg^‑1.mol^‑1 reakce mezi dvěma redox systémy: (ox)[1] +(red)[2] U (red)[1]+ (ox)[2 ] Pokud je systém v rovnováze, platí DG = 0 a E[1]= E[2 ] E[01] + RT ln [ox[1] ] = E[02] + RT ln [ox[2] ] nF [red[1]] nF [red[2]] E[01] ‑ E[02] = RT ln [ox[2] ][red[1]] nF [red[2]][ox[1] ] K = [ox[2] ][red[1]] [ox[1] ][red[2]] E[01]‑ E[02] = RT ln K nF DG[o]= ‑RT lnK E[01]‑ E[02] = ‑ DG[o ] nF DG[o ] = ‑nF(E[01] ‑ E[02]) DG[o ] = ‑nF DE[o] kde DE[o]= E[o ox]‑E[o red] Tab.III Hodnoty standartních redox potenciálů některých důležitých redoxních párů při pH 7 E[o] ´(V) acetát/acetaldehyd ‑0.58 NAD+/NADH ‑0.32 NADP+/NADPH ‑0.324 acetaldehyd/ethanol ‑0.197 pyruvát/laktát ‑0.185 oxalacetát/malát ‑0.166 ubichinon/ubihydrochinon +0.10 2cyt b(ox)/2cyt b(red) +0.03 fumaran/jantaran +0.031 2cyt c(ox)/2cyt c(red) +0.235 2cyt a(ox)/2cyt a(red) +0.385 1/2 O[2] /H[2]O +0.816 1. Vypočítejte redoxní potenciál E směsi NAD/NADH, je‑li koncentrace NAD 1 mmol.l^‑1, NADH 10 mmol.l^‑1. 2. Srovnáním standartních redox potenciálů určete, zda reakce bude mít tendenci probíhat doleva nebo doprava: malát + NAD^+ U oxalacetát + NADH + H^+ pyruvát + NADH + H^+U laktát + NAD^+ malát + pyruvát U oxalacetát + laktát acetaldehyd + fumarát U acetát + jantaran 3. Vypočítejte rovnovážnou konstantu reakce ze standartního redox potenciálu E[o] (T = 25^oC) malát + NAD^+ U oxalacetát + NADH + H^+ 4. Vypočítejte, jaký musí být poměr koncentrací NAD/NADH, aby reakce: pyruvát + NADH + H^+ U laktát + NAD^+ byla při 25^oC v rovnováze, je‑li poměr koncentrací pyruvát/laktát = 1. 5. Vypočítejte DG reakce: jantaran + NAD^+ U fumaran + NADH + H^+ je‑li koncentrace NAD 10 mmol.l^‑1, NADH 1 mmol.l^‑1, jantaranu 10 mmol.l^‑1, fumaranu 5 mmol.l^‑1, T = 25^oC. 6. Vypočítejte DG reakce při 25^oC: NADH + H^+ + UQ U UQH[2] + NAD^+ Je‑li koncentrace NAD 100krát vyšší než koncentrace NADH a koncentrace UQH[2] 2krát vyšší než koncentrace UQ. E[UQ]= +0.104 V, E[NADH] = ‑0.32 V 7. Určete DGo reakce: acetaldehyd + fumarát U acetát + jantaran Eo acetát = ‑0.58 V, Eo fumar. = 0.03 V. V jakém směru bude reakce probíhat. 8. Určete DGo reakce: cytochrom c^2+ + cyt a^3+ U cyt c^3+ + cyt a^2+ Eo cyt c (2+/3+)= +0,235 V, Eo cyt a(2+/3+) =+0,385 V. V jakém směru bude reakce probíhat. 9. Vypočítejte DGo reakce: cyt a(red) + 1/2 O[2] + 2H+ U cyt a(ox) + H[2]O Eo (cyt a) = 0.385 V , Eo(O)= 0.816 V. Je‑li DGo syntézy ATP z ADP a Pi +30 kJ.mol^-1, kolik molekul ATP může vzniknout při této reakci za standardních podmínek? 10. Vypočítejte, jaký je poměr koncentrací NAD/NADH u alkoholického kvašení v rovnováze, pokud by koncentrace alkoholu byla 5% a koncentrace acetaldehydu 0,5 mmol.l^-1. Hustota roztoku alkoholu = 1 g.ml^-1. NADH + H^+ + aldehyd ® NAD + alkohol Eo alkohol/aldehyd = -0,197 V; Eo NADH/NAD = -0,32 V. 11. Dokažte pomocí výpočtu DG, zda při oxidaci acetaldehydu na acetát je vhodnějším koenzymem NAD nebo FAD. Acetaldehyd + oxid. koenzym ® acetát + red. koenzym Při výpočtu berte v úvahu situaci, kdy poměr reduk. konezym/oxid. koenzym = 1/100 a koncentrace acetaldehydu a acetátu je ekvimolární. Eo acetaldehyd = -0,58 V, Eo NADH = -0,32 V, Eo FADH2 = 0 V H KREBSUV CYKLUS 1. Srovnejte G[o] reakcí Krebsova cyklu. Které reakce mají tendenci probíhat obráceným směrem a jakým způsobem dochází k posunu reakcí žádoucím směrem? 2. V kterém místě cyklu trikarbonových kyselin dochází k dekarboxylaci : Přeměna: a) citrátu na akonitát, b) isocitrátu na oxoglutarát, c) malátu na oxalacetát, d) oxalsukcinátu na 2-oxoglutarát ,e) 2-oxoglutarátu na sukcinylKoA 3. V kterém místě cyklu trikarbonových kyselin dochází k oxidaci substrátu Přeměna a) sukcinátu na fumarát b) 2-oxoglutarátu na sukcinyl-CoA c) fumarátu na malát d) oxalacetátu na citrát e) acetylkoenzym A na citrát 4. Napište bilanční rovnici přeměny oxoglutarátu na jantaran v Krebsově cyklu. 5. Jaké jsou rovnovážné relativní koncentrace isocitrátu, citrátu a cis‑akonitátu, je‑li DG[o] reakcí následující: 1/ citrát U cis‑akonitát + H[2]O DG[o] =+8.4 kJ.mol^‑1 2/ cis‑akonitát + H[2]O U isocitrát DG[o] =‑2.11 kJ.mol^‑1 6. Napište bilanční rovnice přeměny těchto látek v Krebsově cyklu do stadia oxalacetátu: a) citrát b) jantaran c) malát Napište vzorce uvedených karboxylových kyselin. 7. Jaká je distribuce uhlíku ^14C na oxalacetátu po přidání pyruvátu značeného na a) C1, b) na C2, c) na C3 k enzymům Krebsova cyklu a k pyruvát dekarboxylase? 8 K enzymům Krebsova cyklu byla přidán acetylKoA značený ^13C na methylové skupině. Dokažte, jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklém citrátu a jaká ve vzniklém isocitrátu 9. Na základě hodnoty G[o] vypočtené ze standartních redox potenciálů zdůvodněte, proč oxidace jantaranu na fumaran v Krebsově cyklu probíhá za účasti FAD jako koenzymu a nikoliv NAD^+. jantaran + FAD U fumaran + FADH[2 ] jantaran + NAD+ U fumaran + NADH + H^+ (Eo [FAD/FADH2]= 0.0 V) 10. Navrhněte hypotetický cyklus analogický Krebsově cyklu, kde by jako počáteční krok byla reakce acetylKoA s oxoglutarátem namísto s oxalacetátem. I ANAEROBNÍ GLYKOLÝZA 1. Napište vzorce: kys. 1,3 bis fosfoglycerové, fosfoenolpyruvátu. K aldolase byl přidán fruktosa 1,6 bis fosfát značený na C2. Jaká bude distribuce radioaktivity ve vzniklé triose. 2. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3P glycerová značená na uhlíku č.2. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa-1,6-bis fosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa‑1,6 bis fosfátu. 3. Fruktosa 1,6‑bisfosfát byl značen fosfátem ^32P na uhlíku číslo 1. Prokažte, zda se tento značený fosfát objeví ve formě ATP, pokud anaerobní glykolýza proběhla do stadia kys. 3‑fosfoglycerové. 4. Napište bilanční rovnici přeměny glyceraldehyd‑3‑P na fruktosa‑6‑P v procesu glukoneogeneze: Glycerald‑3‑P + A + B +... U fruktosa‑6‑P + X + Y + ... 5. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa‑6‑fosfátu na kys. 3‑fosfoglycerovou v procesu anaerobní glykolýzy. Fru‑6‑P + X + Y + ... U kys.3‑P‑glycer. + A + B +... 6. Látka A je produktem anaerobní glykolýzy. Její redukcí NADH vzniká látka B. Transaminací látky A vzniká látka C. Napište názvy a vzorce látek A,B,C. 7. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosy na pyruvát v procesu anaerobní glykolysy za předpokladu: a) fosforylace fruktosy hexokinasou fruktosa + ATP Ufruktosa‑6‑P + ADP b) fosforylace fruktosy fruktokinasou fruktosa + ATP Ufruktosa‑1‑P + ADP 8.. Napište bilanční rovnici přeměny fruktosa‑1,6‑bisP na fosfoenolpyruvát při anaerobní glykolyse a) v přítomnosti NAD, Pi a ADP b) v přítomnosti NAD+, ADP, arseničnanu 9. Glukosa byla značena ^14C. Jaká bude distribuce značeného uhlíku v pyruvátu po přeměně značené glukosy v procesu anaerobní glykolysy. a) v případě značení na C1 b) v případě značení na C6 (izomerace glyceraldehydfosfátu na dihydroxyacetonfosfát je velmi rychlá vzhledem k následujícícmu kroku). 10. Jaká bude rovnovážná koncentrace fruktosa‑1,6‑bisfosfátu, glyceraldehyd‑3‑fosfátu a dihydroxyacetonfosfátu, jestliže fruktosa‑1,6‑bisfosfát 1 mmol.l^‑1 byl inkubován s aldolasou ( DG[o] = + 24 kJ.mol^-1). 11. Zdůvodněte, proč při anaerobní glykolyse musí být glukosa‑6‑fosfát izomerován na fruktosa‑6‑fosfát. Vezměte v úvahu reakční mechanismus aldolasové reakce. Proč tato reakce probíhá s fruktosa‑1,6‑bisfosfátem a nikoliv s glukosa‑1,6‑bis fosfátem? 12. Glukosa značená ^14C na C1 byla přidána do směsi obsahující enzymy pentosového cyklu. Jaký je osud radioaktivně značeního uhlíku při přeměně na dvě molekuly triosy ? 13. K enzymům anaerobní glykolysy byla přidána kys. 3P glycerová značená na uhlíku karboxylové skupiny. Zvratem anaerobní glykolysy byl z této kyseliny synthezován fruktosa‑1,6‑bisfosfát. Jaká bude distribuce radioaktivity v tomto fruktosa‑1,6‑bisfosfátu. 14. Na základě velikosti DGo odhadněte, které reakce nemohou při glukoneogenesi probíhat zvratem anaerobní glykolysy. Jakým způsobem jsou tyto reakce obcházeny? (Jedna z reakcí probíhá přes nepříznivé DGo. Odhadněte proč.) 15. Určité bakteriální mutanty mají nefunkční triosafosfát izomerázu. Vysvětlete, proč je tato mutace letální pro organismus fermentující glukosu výlučně cestou anaerobní glykolýzy. 16. Vysoké koncetrace pyruvátu inhibují izoenzym laktátdehydrogenasy srdečního svalu, nikoli však izoenzym ze svalu kosterního. Jaké by byly důsledky tohoto efektu, kdyby srdeční sval obsahoval pouze izoenzym totožný s izoenzymem kosterního svalu. Jaké by byly obrácené důsledky, kdyby kosterní sval obsahoval izoenzym totožný s izoenzymem srdečním? 17. Při glukoneogenezi je termodynamická bariéra tvorby fosfoenolpyruvátu obcházena tvorbou oxalacetátu (koenzym biotin). Napište obě dvě rovnice použité k obchvatu pyruvát kinázové reakce a vypočítejte DGo souhrnné reakce. (Předpokládejte, že GTP je termodynamicky ekvivalentní ATP). J RESPIRAČNÍ ŘETĚZEC 1. Rozdělte jednotlivé složky respiračního řetězce na jednoelektronové a dvouelektronové přenašeče. Napište redoxní rovnice mezi uvedenými partnery a všimněte si, kde vystupuje jako reakční partner H^+. NADH ‑ UQ UQH[2]‑Cyt c cyt b‑cyt c cyt a‑ 1/2 O[2 ] cyt c‑cyt a 2. Vypočítejte DG[o] reakce mezi: a) NADH ‑ UQ b) jantaran ‑ UQ c) cyt b(red) ‑ cyt c(ox) d) cyt c(red) ‑ 1/2 O[2 ]Na základě velikosti G[o] odhadněte, při které reakci je kryta energetická spotřeba vzniku jedné molekuly ATP ( G[o]=‑30 kJ.mol^‑1). 3. Vypočítejte G[o] oxidace NADH kyslíkem v respiračním řetězci. Kolik molů ATP by teoreticky vzniklo za standartních podmínek ( G[o ATP] = ‑3O kJ.mol^‑1). Jestliže namísto kyslíku použijeme umě‑ lého akceptoru hexakyanoželezitanu (E[o]= +0,36 V), jaká bude změna standartní volné energie reakce a kolik molů ATP vznikne? 4. Doplňte bilanční rovnici přeměny následujících látek v Krebsově cyklu a v respiračním řetězci: jantaran + ADP + 1/2 O[2] U fumaran + ATP isocitrát + ADP + 1/2 O[2] U jantaran + ATP jantaran + ADP + 1/2 O[2] U oxalacetát + ATP 5. Po přídavku inhibitoru respirace antimycinu k systému repiračního řetězce mitochondrií byla zjištěno úplné zredukování ubichinonu, cytochromu b a úplné zoxidování cytochromů c, aa3. Zakreslete místo zásahu tohoto inhibitoru. 6. Doplňte bilanční rovnici přeměny fumaranu na oxalacetát za spolupráce enzymů Krebsova cyklu a respiračního řetězce: fumaran + ADP + .... U oxalacetát + ATP + .... 2-oxoglutarát + ADP +.....U fumaran + ATP + ..... 7. Vypočítejte DGo reakce při 25^oC fumaran + NADH + H+U jantaran + NAD víte‑li, že: Eo NAD/NADH = ‑0.32 V, Eo fum/jan= +0.03 V Bylo by možné, aby za standartních podmínek byla tato reakce využita k syntéze ATP? ( hydrolýza ATP DGo=‑30 kJ/mol) Zakreslete úseky respiračního řetězce, které se podílejí na této oxidaci NADH. K FOTOSYNTÉZA Souhrnná rovnice: 2 ferred.(red) + NADP + H^+ U 2 ferred.(ox) + NADPH H[2]O + ADP + Pi + A[ox] U 1/2O[2] + 2H^+ + ATP + A[red ] Temná fáze fixace: CO[2] + ribulosa‑1,5‑bisP + H[2]O U 2 kys. 3‑Pglycerová redukce: kys.3‑Pglycerová + NADPH + ATP U glycerald.‑3‑P + NADP + ADP + Pi + H[2]0 syntéza hexózy: 2P- 3 ® P- 6 + Pi regenerace: P- 6 P - 5 + P- 3 P - 4 + 3 ATP ® 3 P- 5 -P + 3ADP P- 7 P- 5 P - 3 P- 3 P- 5 souhrnná rovnice: 5 P- 3 + 3 ATP ® 3 P- 5 -P + 3 ADP + 2Pi 1. Napište souhrnnou rovnici světelné fáze fotosynthesy ve fotosystému I, fotosystému II a souhrnnou rovnici při propojení obou fotosystémů. Pokuste se napsat souhrnnou rovnici temné fáze fotosynthesy s oxidem uhličitým na jedné straně a s triosofosfátem na straně druhé. Vodu nutnou pro hydrolýzu ATP zanedbejte. 2. Vypočítejte E[o] a DG[o] reakce mezi redukovaným ferredoxinem a NADP při fotosynthese (Eo ferredoxinu = ‑0.43 V). 3. K enzymům temné fáze fotosynthesy (fixace CO[2]) byl přidán ribulosa‑1,5‑bisfosfát a ^14CO[2]. Jaká bude distribuce radioaktivity v kyselině 3‑fosfoglycerové? Jaká bude distribuce readioktivity v tomtéž případě, pokud byl přidán neznačený CO[2] a ribulosa‑1,5bis fosfát značený na C5? 4. Srovnejte proces redukce kys. 3‑fosfoglycerové na glyceraldehyd‑3‑ fosfát při fotosynthese a vratný proces oxidace glyceraldehyd‑3‑fosfátu při anaerobní glykolyse. V čem se oba procesy liší? 5. Fotosystém I má v základním stavu standartní redox potenciál E[o]= +0,46 V. Po absorpci světelného kvanta se jeho potenciál změní na E[o]= ‑0,60 V. Vypočítejte rovnovážný poměr koncentrací NADPH/NADP v reakci: 2 fotosys.I(red) + NADP + H+ U 2 fotosys.I (ox) + NADPH s fotosystémem I v základním a excitovaném stavu. Poměr koncentrací oxidovaného a redukovaného fotosystému je roven 1, T = 25^oC. 6. Dokažte výpočtem DG, zda redukovaný ferredoxin (Eo =‑0,43 V) je při fotosyntéze schopen redukovat NADP (Eo = ‑0,324 V), pokud poměr koncentrací NADPH/NADP je při 25°C roven 100. Výchozí poměr redukovaného a oxidovaného ferredoxinu je roven 1. Napište rovnici této reakce. 7. Jeden z používaných herbicidů diuron je známým inhibitorem fotosyntézy. Tento inhibitor blokuje syntézu NADPH v chloroplastech, přičemž plastochinon se zcela zredukuje. Zakreslete pravděpodobné místo zásahu. 8. Určité primitivní fotosyntetizující bakterie žijící poblíž podmořských sopek obsahují bakteriochlorofyl a fotosystém II. Produktem této fotosyntézy je síra. Vysvětlete pomocí schématu rovnice. VÝSLEDKY ÚLOH D 2. A[260]=[AMP] × e[260](AMP) + [GMP] × e[260](GMP) A[280]=[AMP] × e[280](AMP) + [GMP] × e[280](GMP) [GMP]=3,07.10^-5 mol/l, [AMP]=1,90.10^-5 mol/l 4. RNA 321, DNA 309 5. a/ UpCpUpApGpA b/ Up+ CpUpApGpAp, Up+Cp+UpApGpAp, Up+Cp+Up+ApGpAp atd. c/ UpCpUpApG+pAp, UpCpUpA+pG+pAp, UpCpU+pA+pG+pAp atd. d/ UpCpUpA+pGpAp e/ UpCpU+pA+pG+pAp 6. fosfodiesteráza hadího jedu: ^32pApCpTpTpA+pG, ^32pApCpTpT+pA+pG,^ 32pApCpT+pT+pA+pG, ^32pApC+pT+pT+pA+pG (poslední dinukleotid nechá nerozštěpený) desoxyribonukleáza II: ^32pAp+CpTpTpApG, ^32pApCp+TpTpApG, ^32pApCpTp+TpApG, ^32pApCpTpTp+ApG, ^32pApCpTpTpAp+G a další 6. a) pC…je na volném 3´ konci RNA b) pankreatická ribonukleáza rozštěpí polynukleotid (psáno od 5´konce k 3´konci) za U a C možnosti: ACAGUC ACGAUC GAUACC AGUACC c) A bude na začátku možnosti: AGCAUC…vyřazeno z důvodů b) ACGAUC AGCACU…nesplňuje podmínku a) ACGACU…nesplňuje podmínku a) řešení:(pApCpGpApUpC) 8. (-ATAGGCTTAGTACCA-) 9. -TCGCATC-, -UCGCAUC- 10. a/ GATCAA palindrom:GATC CTAGTT CTAG b/ TGGAAC palindrom není ACCTTG c/ GAATTC celé palindrom CTTAAG d/ ACGCGT celé palindrom TGCGCA e/ CGGCCG celé palindrom GCCGGC f/ TACCAT palindrom není ATGGTA 11. 617,5; 1,82.10^6 Da, 3,02.10^-18 g 12. a) 1,43.10^11 Da b) 2,32.10^8 pb, 0,079 m 13. 67,2% G+C, 32,8% A + T, molární poměr purinových a pyrimidinových bazí je 1:1, molární složení: 33,6 % G, 33,6% C, 16,4% A, 16,4% T 14. Phe®Leu, Ala®Thr, Ile®Leu, Pro®Ser- 15. a) 8500 pb b) rozdíl v molekulové hmotnosti je 5,25.10^6 Da, což je 8,72.10^-18 g c) 2833 kodonů a tedy aminokyselin, což je 3,97.10^5 Da 16. 100 řetězců, průměrná délka 300 bazí (za předpokladu, že polymerace proběhne v obou pokusech stejně) 17. TTC GAA pro Phe a Glu, TTT GAG ATC TTG GAG CGG CGG nebo TTT GAG ATC TTA GAG CGG CGG 18. a)jednoduchá šroubovice b)G 19%, T 25%, A 33%, C 23% c)G 21%, T 29%, A 29%, C 21% d)nový řetězec DNA 19. frekvence kodonů: UUU 0,9.0,9.0,9= 72,9% Phe UUC 0,9.0,9.0,1= 8,1% Phe UCU 8,1% Ser CUU 8,1% Leu UCC 0,9% Ser CUC 0,9% Leu CCU 0,9% Pro CCC 0,1% Pro Po součtu dostáváváme teoretické aminokyselinové složení shodné s experimentálním. 20. frekvence kodonů: GGG 12,5% Gly GAA 12,5% Glu AGA 12,5% Arg AAG 12,5% Lys GGA 12,5% Gly GAG 12,5% Glu AGG 12,5% Arg AAA 12,5% Lys Syntezovaný polypeptid bude obsahovat 25% glutamátu. 21. strukturní gen: 750 nukleotidů (+ iniciační a terminační kodony) serin je v aktivním centru G 1. E=‑0,35 V 2. doleva, doprava, doleva, doprava 3. Při výpočtu DE^O odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované. +29,7 kJ/mol, 6,13.10^‑6 4. [laktát]/[pyruvát]=1 DE^0= E^0/[LAK]- E^0/[NAD]=-0,185-(-0,32)=0,135V DE^0= (R×T/n×F) × ln([laktát]×[NAD^+]/[pyruvát]×[NADH]) [NAD^+]/[NADH]=3,71× 10^4 5. DE^0= -0,32-(-0,031)= -0,351V DG^0= 67,7 kJ/mol DG= DG^0 + R×T× ln ([fumaran]×[NADH]/[jantaran]×[NAD^+])=+60,3 kJ/mol 6. DE^0=0,104-(-0,32)= 0,424V DG^0= -81,8 kJ/mol DG= DG^0 + R×T× ln ([UQH[2]]×[NAD^+]/[UQ]×[NADH])= -68,7 kJ/mol 7. DE^0= 0,03-(-0,58)= 0,61V DG^0= -117,7 kJ/mol Reakce probíhá doprava. 8. DG^0= -14,5 kJ.mol^-1 Reakce probíhá doprava. 9. DG^0= -83 kJ.mol-1, 2-3 molekuly ATP 10. [alkohol]=(5/46,0829)/0,1= 1,0854mol/l DE^0=0,123V DG^0= -23,74 kJ/mol [NAD^+]/[NADH^+]=6,71 11. NAD^+: DE^0=0,26 V, DG^0= -50,2 kJ/mol, DG= -61,6 kJ/mol FAD: DE^0=0,58 V, DG^0= 111,9 kJ/mol, DG= 100,5 kJ/mol H 1. malát + NAD^+ ® oxalacetát + NADH + H^+ citrát ® isocitrát 2. b,e 3. a,b 4. oxoglutarát + NAD^+ + GDP + P ® jantaran + CO[2] + NADH + H^+ + GTP 5. K[1]=0,0336397 K[2]=2,3444484 citrát ® isocitrát, DG^0= 6,29 kJ/mol, K=0,0788666 cis-akonitát/citrát=0,0336, isocitrát/cis-akonitát=2,3444, isocitrát/citrát=0,07887 [citrát]=1, [isocitrát]=0,07887, [cis-akonitát]=0,03364, tedy 0,079:1:0,034 6. postupným sčítáním reaktantů a produktů dostaneme bilanční rovnice: a) citrát + 3 NAD^+ + GDP + P + FAD + H[2]O ® oxalacetát + 2CO[2] + 3 NADH + 3H^+ + + GTP + FADH[2 ]b) jantaran + FAD + H[2]O + NAD^+ ® oxalacetát + FADH[2] + NADH + H^+ c) malát + NAD^+ ® oxalacetát + NADH + H^+ 7. U tohoto typu úloh se uvažuje pouze první průchod cyklem trikarbonových kyselin, v dalších krocích by se značený ^14C objevoval i v jiných pozicích. a) uvolní se jako ^14CO[2 ]b) C1 oxalacetátu c) C2 a C4 oxalacetátu 2. v citrátu na C2 v isocitrátu na C2 a C4 8. reakce s FAD: DG^0=5,98 kJ/mol reakce s NAD^+: DG^0=67,7 kJ/mol 10. I 1. C2 obou trios 2. 2,5 3. ne 4. 2 glyceraldehyd-3-P + H[2]O ® fruktosa-6-P + P 5. fruktosa-6-P + 2 P + ADP+ 2 NAD^+ ® 2 kys.3-P-glycerová + ATP + 2 NADH + 2 H^+ 1NADH je ekvivalentní 3ATP fruktosa-6-P + 8 P + 7 ADP ® 2 kys.3-P-glycerová + 7 ATP 6. pyruvát, laktát, alanin 7. a) hexokinasa fruktosa + 2 ATP + 2 NAD^+ + 2 P + 4 ADP® 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H^+ + 4 ATP fruktosa + 8 ADP + 8 P ® 2 pyruvát + 8 ATP b) fruktokinasa fruktosa + 2 ATP + 2 NAD^+ + 2 P + 4 ADP® 2 pyruvát + 2 ADP + 2 NADH + 2 H^+ + 4 ATP fruktosa + 8 ADP + 8 P ® 2 pyruvát + 8 ATP 8. a) fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD^+ + 2 P + 2 ADP ® 2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH + 2H^+ + 2 ATP + 2 H[2]O b) neproběhne, nevzniká ATP (arseničnan nahrazuje v reakcích fosfát, ale estery s arseničnanem okamžitě hydrolyzují) fruktosa-1,6-bisP + 2 NAD^+ + 2 HAsO[4]^2- + 2 H[2]O® 2 fosfoenolpyruvát + 2 NADH + 2H^+ + 2 HAsO[4]^2- + 2 H[2]O 9. methylová skupina v obou případech 10. 0,22 GAP a DHAP, 0,78 mM FBF 11. mechanismus aldolové kondenzace 12. odštěpí se jako ^14CO[2 ]13. C3, C4 14. i) fruktosa-1,6-bisP + ADP ® fruktosa-6-P + ATP NEPROBÍHÁ(DG^O=+14,2kJ/mol) ve skutečnosti: fruktosa-1,6-bisP + H[2]O ® fruktosa-6-P + P FRUKTOSABISFOSFATASA ii) glukosa-6-P + ADP ® glukosa + ATP NEPROBÍHÁ(DG^O=16,7kJ/mol) ve skutečnosti: glukosa-6-P + H[2]O ® glukosa + P GLUKOSA-6-FOSFATASA iii) pyruvát + ATP ® fosfoenolpyruvát + ADP NEPROBÍHÁ (DG^O= +31kJ/mol) ve skutečnosti: a) fosfoenolpyruvátsynthetasa (bakterie) b) pyruvát + ATP + CO[2] ® oxalacetát + ADP + P oxalacetát + GTP ® fosfoenolpyruvát + GDP + CO[2 ] Přes nepříznivé DG^O probíhá reakce: fruktosa-1,6-bisP ® glyceraldehydfosfát + dihydroxyacetonfosfát 15. hromadí se dihydroxyacetonfosfát dle výsledné bilanční rovnice: glukosa + P ® dihydroxyacetonfosfát + laktát NEPRODUKUJE SE ENERGIE! 16. LDH srdečního svalu (izoenzym H[4]) je vhodnější pro oxidaci laktátu na pyruvát. Pokud by se zde uplatnila LDH kosterního svalu, mohl by se v srdečním svalu hromadit laktát. LDH kosterního svalu (izoenzym M[4]) je lépe uzpůsobena pro oxidaci pyruvátu na laktát, což umožňuje kosternímu svalu pracovat na "kyslíkový dluh". Při nedostatku kyslíku se hromadí NADH vznikající při anaerobní glykolýze a likviduje se redukcí pyruvátu na laktát (únava). Svalové buňky předávají laktát do krve, následně může být v játrech přeměněn na glukosu. 17. I) pyruvát + ATP + CO[2] ® oxalacetát + ADP + P II) oxalacetát + GTP ® fosfoenolpyruvát + CO[2] + GDP Souhrnná reakce: pyruvát + 2 ATP ® fosfoenolpyruvát + 2 ADP + P [součet: a) pyruvát + ATP ® fosfoenolpyruvát + ADP (DG^O= +31kJ/mol) b) ATP = ADP + P (DG^O= -30,5kJ/mol)] DG^O(celk) = +0,5 kJ/mol J 1. jednoelektronové: cyt c, cyt b, cyt a, UQ dvouelektronové: NADH NADH + H^+ + UQ ® NAD^+ + UQH[2 ]UQH[2] + cyt c (ox) ® UQH× + H^+ + cyt c (red) UQH[2] + 2 cyt c (ox) ® UQ + 2H^+ + 2 cyt c (red) cyt c (red) + cyt b (ox) ® cyt c (ox) + cyt b (red) 2 cyt a (red) + 1/2 O[2] + 2H^+® 2 cyt a (ox) + H[2]O cyt c (red) + cyt a (ox) ® cyt c (ox) + cyt a (red) 2. Ve vzorci DG^O= -n × F × DE^O se při výpočtu DE^O odečítá od redoxního potenciálu složky, která vystupuje na levé straně rovnice v oxidované podobě, redoxní potenciál složky, která je zde v podobě redukované. a) NADH + H^+ + UQ ® NAD^+ + UQH[2 ] E^0/[NAD+]= -0,32V E^0/[UQ]= +0,10V DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,10-(-0,32))= -81,06 kJ/mol Kryta energetická spotřeba vzniku dvou ATP. b) jantaran + UQ ® fumarát + UQH[2 ] E^0/[fum]= 0,031V E^0/[UQ]= 0,10V DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,1-0,031)= -13,317 kJ/mol c) 2 cyt b (red) + 2 cyt c (ox) ® 2 cyt b (ox) + 2 cyt c (red) DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,235-0,03)= -39,57 kJ/mol Kryta energická spotřeba vzniku jednoho ATP. d) 2 cyt c (red) + 1/2 O[2] + 2H^+ ® 2 cyt c (ox) + H[2]O DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,816-0,235)= -112,13 kJ/mol Kryta energetická spotřeba vzniku tří ATP. 3. a) NADH + 1/2 O[2] + H^+ ® NAD^+ + H[2]O DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,816-(-0,32))= -219,25 kJ/mol Teoreticky by vzniklo 7,3 molů ATP. b) NADH + 2 [Fe(CN)[6]]^3- ® NAD^+ + H^+ + 2 [Fe(CN)[6]]^4- DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,36-(-0,32)= -131,24 kJ/mol Teoreticky by vzniklo 4,4 molů ATP. 4. jantaran + 2 ADP + 1/2 O[2] ® fumaran + 2 ATP + H[2]O + 2P isocitrát + 7 ADP + 7P + O[2] ® jantaran + 2 CO[2] + 7 ATP + 2 H[2]O jantaran + 5 ADP + 5P + O[2] + H[2]O ® oxalacetát + 5 ATP + 2 H[2]O 5. Antimycin je inhibitorem komplexu III, zasahuje v místě cytochromu bc[1]. 6. fumaran + 3 ADP + 3P + 1/2O[2] ® oxalacetát + 3 ATP + H[2]O 2-oxoglutarát + 6 ADP + 6P + O[2] ® fumaran + 6 ATP + CO[2] + H[2]O 7. DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (0,03-(-0,32))= -67,55 kJ/mol Tato reakce by mohla být využita k syntéze 2,2 molů ATP. K 1. souhrnná rovnice pro fotosystém I: 2 PSI^* (red) + NADP^+ + H^+ ® 2 PSI (ox) + NADPH souhrnná rovnice pro fotosystém II: 4 PSII (ox) + 2 H[2]O ® 4 PSII (red) + O[2] + 4 H^+ souhrnná rovnice pro oba fotosystémy: 2 H[2]O + 2 NADP^+ ® O[2] + 2H^+ + 2 NADPH temná fáze fotosyntézy: 3CO[2] + 6NADPH + 6H^+ + 9ATP ® glyceradehydfosfát + 6NADP + 9ADP + 8P + 3H[2]O 2. 2 ferredoxin (red) + NADP + H^+ ® 2 ferredoxin (ox) + NADPH DG^O= -21 kJ/mol DE^O= 0,106 V 3. na C1 v prvním případě, na C3 ve druhém případě 4. lokalizace: chloroplasty (NADPH) X cytoplazma (NADH) 5. 2 fotosystém I (red) + NADP + H^+ ® 2 fotosystém I (ox) + NADPH DE^O[NADP]= -0,324 V základní stav: DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (-0,324-0,46) DG^O= 151,312 kJ/mol= -R × T × ln([fot I (ox)]^2 × [NADPH]/ [fot I (red)]^2 × [NADP]) [NADPH] / [NADP] = 2.995 × 10^-27 excitovaný stav: DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (-0,324-(-0,60)) DG^O= -53,268 kJ/mol= -R × T × lnK [fot I (ox)]^2 × [NADPH]/ [fot I (red)]^2 × [NADP]= 2,175 × 10^9 [NADPH] / [NADP] = 2,175 × 10^9 6. 2 ferredoxin (red) + NADP + H^+ ® 2 ferredoxin (ox) + NADPH DG^O= -n × F × DE^O= -2 × 96500 × (-0,324-(-0,43))= -20,46 kJ/mol DG = DG^O + R × T × ln ([ferr(ox)]^2 × [NADPH]/[ferr(red)]^2× [NADP]) DG = -20460 + 8,31 × 298 × ln (100)= -9056 J/mol…samovolný průběh poměr v rovnováze: ferr(ox)/ferr(red)= 6,2 Redukovaný ferredoxin je schopen redukovat NADP, dokud se poměr ferr(ox)/ferr(red) nezmění z 1 na 6,2. 7. diuron zasahuje v místě komplexu b[6]f 8. Jedná se o zelené sirné bakterie (rod Chlorobium) patřící mezi obligátně fototrofní organismy. Jsou inhibovány vyšší tenzí O[2]. rovnice fotosyntézy: 2H[2]S + CO[2] ® {CH[2]O} + H[2]O + 2S, kde {CH[2]O} je např.cukr