MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra 2 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Koncentrace n složek ve směsi, z nichž každá poskytuje analytický signál při nejméně jedné vlnové délce, lze určit na základě měření signálů na n vlnových délkách a řešením soustavy rovnic o n neznámých. Tento výpočet je principielně umožněn aditivitou absorbancí: platnost Bouguert-Lambert-Beerova zákona Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) MA je založena na aditivitě absorbancí Ajje absorbance při vlnové délce ^ ajjje absorpční koeficient i-té komponenty při j-té vlnové délce Cj je koncentrace i-té složky I je tloušťka absorbující vrstvy; dále I = 1 Určení počtu absorbujících komponent S graficky S numericky Strukturní změny na chromoforech =^> více izolovaných chromoforů v jedné absorbující komponentě =^> počet maxim > počet absorbujících komponent Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) 1,5n 51) Jožj^i J B Jožka 2 Výsledné součtové spektrum 1+2 aSj je absorpční koeficient i-té komponenty při j-té vlnové délce 0.5- 22 D Wavelength [nm] KD Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Numerické řešení - eliminační metoda pro soustavu rovnic - nejjednodušší případ = dvousložkový systém A — ďwwlxw i dpwtyp 4 A2 — dwpCyw ~T dpoCyp A2 Cl = /ijdno #10 Ci 21 U<| 1^00 01 10 c2 = /ípcíww /iwd 72 &*f *f& jn & Jsf&sf O Uw — x\w / c/ww Op — Ci.* p xv* Ct.* ^ x\- a7ía22 a2í=0 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Řešení soustavy rovnic o 2 neznámých: 2-složková soust. = Cramerovo pravidlo c2 = \21 \22 a11 A a22 A2 ai1 ai2 a21 a22 ai1. . ai2 X d 21 a22 — Uj i^OO 1 *? *?1 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Třísložková soustava - rovnice o 3 neznámých A — d11C1 + d21^2 ~*~ ^31^3 K A2 — &aj\ja "T" G nnKs n ~T~ Ccopvo A2 A3 = ^13^1 ~*~ "23^2 ~*~ ^33^3 Á3 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Determinanty 3. řádu, Sarussovo pravidlo A a21 a31 Di = A2 a22 a32 A a23 a33 aii a21 a31 D = ai2 a22 a32 ai3 a23 a33 l11 A a D n — ČLo r\ 12 l13 A 31 x32 l33 D3 = a11 a21 ai2 a22 ai3 a23 A A A, c^D^/D c2=D2/D c3=D3/D Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Přesnost a správnost závisí na a) počtu komponent b) volbě vlnových délek Pro každou složku hledáme K}, kde je absorpční koeficient dané složky podstatně větší než absorpční koeficienty této složky při ostatních Áj Pro i-tou složku se hledá hodnota rjj(max) v závislosti na Áj, Obvykle tyto absorpční koeficienty jsou indexovány: &11 // &12> 13> 14 '" 1 j '" 1n Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Na hlavní diagonále matice prvků dnC/leží tedy obvykle maximální hodnoty pro každý řádek: • a11 C1, a22 C2 > **33 ^3' ••• **nn ^n > • Absorpční koeficienty se určují s jednosložkovými roztoky • Počet vlnových délek, při nichž provádíme měření, ve vztahu k počtu absorbujících složek: ^- počtu absorbujících složek S> počet absorb, složek (přeurčený systém) Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Vícesložkový systém (> 3) • Nezbytné použít počítač • /- počet složek (n) • j- počet vlnových délek (m) • Numerické metody (determinanty, iterace, Gaussova eliminace, Gauss-Jordanova eliminace) • Vhodný je přeurčený systém m > n, redukuje se na soustavu „normálních rovnic" metodou nejmenších čtverců. Ideální více bodů spektra, celé křivky (CCD) i=n A j =2^aiJci i=1 1,5n Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Tme Measured ?C3 210 220 Wavelength [ma] 73C ?*D Výsledné spektrum 2 složek změřené s 10%-ní chybou (žlutá) a proložená křivka metodu nejmenších čtverců (červená) method of least squares (MLS) Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Přeurčený systém - příklad: dvousložková soustava není popsána 2 vlnovými (210 a 230 nm) délkami, ale 21 datovými body v rozsahu 200-240 nm (krok 2 nm). Pomocí LS (least squares) s prokládají spektra a srovnává se s naměřeným spektrem. Chyba při 2 vlnových délkách může být až 100%, chyba při 21 vlnových délkách je < 1%. Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Soustava m rovnic o n neznámých složkách Á-- LAr\ iC^i l LA^\ iC^} l Lďn 1^0 1 • • • l l^^i ^^ 4 4: — č^ 2Cj + ^22^2 + ^32^3 ~"~ * * * ~"~ ^»2^» K A-• • — ^ 3^1 + ^23^2 + ^33^3 + • • •+^3^7 • • • • • • • • 4s • m • • • • /I3 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) • Schéma transformace přeurčeného systému na systém normálních rovnic • Přeurčený systém: a3x1 + b3x2 + d3x3 +... + n3xn = A3 A3 • • • • • • • • • • • • • • • • • • GfyiJxj i kJ iy.J\ y * ^ m ^ """ m n — ^^m 3 Kde: Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) cL ä cLw, Ow ^ ^21* 1 ~ 31 9o ^ ^72 ' 2 ^ 22 ' 2 ^ 32 Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Normální rovnice [aa]x1 + [ab\x2 + [Qd]x3 +... + [aA7]xn = [aA] [ab]x1 + [bb]x2 + [bd]x3 +... + [bn]xn = [bÁ\ [aafjx^ + [db]x2 + [dd]x3 +... + [dn]xn = [dA] • ••••• • ••••• • ••••• [ad]xr + [db]x2 + [dc/]x3 +... + [dn]xn = [d/\] /cc/e [ab] = y^jalbl = a1b1 + a2Ď2 + a3Ď3 +... +ambt atd. Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) A dále [aÁ\ = ^a,yA, = a1A1 + a2A2 + a3A3 ~T~ . . . \Clm/\m Soustva normálních rovnic je řešena numerickými metodami, Gaussova elininační metoda, Gauss-Jordanova metoda Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) Příklady metod 1. Stanovení Cr2072" a Mn04"v oceli (0,2-5% Mn, 0,2-20% Cr) Fe (III) se maskuje kys. Fosforečnou, X = 440 nm, 545 nm nebo 520 nm. 2. Stanovení Fe(lll), Cu(ll), Co(ll) jako thiokyanáto komplexů, Nadbytek SCN", prostředí 50% aceton, + HCl nebo HN03, X = 380nm, 480 nm a 625 nm. 3. Stanovení Cu(ll), Co(ll), Ni(ll) s diethyldithiokarbamátem. Cheláty kovů se extrahují do chloroformu, X = 436 nm, 367 nm a 328 nm. 4. Stanovení tryptofanu a thyrosinu 5. Stanovení W(VI), Mo(VI), Nb(V) v ocelích,barevné iontové asociáty komplexů s katecholem s butyltrifenyl fosfoniovým kationtem. Selektivní extrakce do chloroformu z 0,5-2,5 M kyseliny sírové. Neruší Fe(ll), Ti(IV), V(V, IV). X = 390nm, 550 nm, 660 nm Vícesložková analýza Multicomponent analysis (MA) EJ «J < 8 = 1 * D, H D. D Srifheirjoglobin Oxyheniodobiu Caibaxvlieuio dobiu Hemoglobin (pH 7.0-7.4) Deox^'benicglcbľii 550 Wavelength [niti] Figure 1? Absorption spectra of LeinogLobiu derivatives