MOLEKULOVÁ ABSORPČNÍ SPEKTROFOTOMETRIE v UV a viditelné oblasti spektra ENERGIE MOLEKULY [• ] E[M] = E[T] + E[R] + E[V] + E[E • ] E[E] > E[V] > E[R] > E[T ]Kvantovaná energie TH energetické hladiny: – Rotační TH přechody mezi rotačními stavy TH rotační spektra (MW) – Vibrační TH přechody mezi vibračními stavy TH vibrační spektra (IR) ΔE[V] » X.10^4 . ΔE[R ]– Elektronové TH přechody mezi elektronovými stavy TH [– ] elektronická spektra (UV-Vis) ΔE[E] » X.10^2 . ΔE[V ]ENERGETICKÉ PŘECHODY V MOLEKULE A MOLEKULOVÁ SPEKTRA ELEKTRONICKÉ PŘECHODY VE FORMALDEHYDU ELEKTROMAGNETICKÉ VLNĚNÍ SPEKTRUM ELEKTROMAGNETICKÉHO ZÁŘENÍ ZÁŘENÍ UV - Vis E = hν = hc/λ VIDITELNÉ SVĚTLO Záření o vlnových délkách 400 - 800 nm je viditelné světlo, které je absorbováno a emitováno elektrony v atomech a molekulách, když přecházejí mezi energetickými hladinami. INTERAKCE ZÁŘENÍ S LÁTKOU • Absorpce 1 • Emise 2 • Luminiscence 3 PROPUSTNOST A BARVA ABSORPCE A KOMPLEMENTÁRNÍ BARVY UV-Vis spektroskopie Fotometrie [• ] Signál: zářivý tok Φ (W), dopadající Φ[0 ]– Emisní – Absorpční – Luminiscenční (fluorescenční, fosforescenční) • Transmitance T = (Φ/Φ[0]); (Φ/Φ[0])´100 (%) • Absorbance A = log(Φ[0]/ Φ)= -log T; 0-L-A -L-YEN Transmitance a délka absorbujícího prostředí: zákon Bouguer-Lambert Transmitance a koncentrace zákon Beerův UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon UV-Vis spektroskopie Bouguert-Lambert-Beerův zákon Bouguert-Lambert-Beerův zákon Derivační spektrofotometrie 1. derivace Derivační spektrofotometrie 2. derivace Derivační spektrofotometrie • S rostoucím n sudé derivace klesá šířka centrálního Gaussova píku • Sudé derivace mají vždy centrální pík s alternujícím znaménkem, který koinciduje s původním píkem(λ[max]) Derivační spektrofotometrie Derivační spektrofotometrie • Derivace Lambert-Beer-Bouguer zákona = zvýšení citlivosti: A = ε·l·c Derivační spektrofotometrie • Velikost derivace v inflexních bodech profilu píku je nezávislá na velikosti pozadí, pokud je v rozsahu Δλ šířky absorpčního pásu přibližně konstantní. • Derivováním spekter superponovaných na zvýšeném pozadí korigujeme pozadí a zvyšujeme poměr S/B, podstatný pro určení meze detekce • Derivace absorpčních pásů na šikmém pozadí (rozptyl záření) umožňuje určit přesnou vlnovou délku λ[max]. Derivační spektrofotometrie Derivační spektrofotometrie Derivační spektrofotometrie Derivační spektrofotometrie • Zlepšení rozlišení překrývajících se absorpčních pásů ] – Odhalení pásů příslušejících nečistotám – Přesné určení λ[max] širokých absorpčních pásů • Zvýšení citlivosti měření • Eliminace pozadí – Rayleighova rozptylu – Konstantního pozadí (v závislosti na λ) – Neselektivní absorpce matrice • Zlepšení poměru signál/pozadí Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 1) Elektronicky: výstupní napětí proporcionální absorbanci je diferencováno vzhledem k času – vhodné pro skenující monochromátory: – Analogové derivační obvody: • Zesilovač • Derivační členy RC • Pásové filtry pro redukci šumů určitých frekvencí • Kombinace derivačních členů pro vyšší derivace Analogová derivační spektrofotometrie – zvýšení citlivosti ve srovnání s „klasickou fotometrií“ 5^n – násobné, kde n = řád derivace x každý RC-člen snižuje poměr S/N faktorem 2. Derivační spektrofotometrie Elektronická tvorba derivačních spekter – diferencování vzhledem k času: Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 2) Opticky: rychlá modulace λ záření ] do kyvety; Modulace λ = rychlé změny λ, periodické skenování ±λ v malém intervalu Δλ; Δλ<< FWHM absorpčního pásu. Derivační spektrum – jako funkce času (konstatní rychlost skenu dλ/dt ) Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter – opticky • Modulace λ: provedení modulace vlnové délky: – rychlým periodickým skenem monochromátoru ±λ – kmitající planparalelní destičkou (posun paprsku) – oscilací vstupní nebo výstupní štěrbiny (změna úhlu dopadu paprsku na mřížku) střídavý fotoproud ~ změně Φ v úzkém intervalu Δλ: 1.derivaci spektra ~ 1. harmonická fotoproudu (AC) 2.derivaci spektra ~ 2. harmonická fotoproudu (AC) Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter – opticky b) Dvouvlnová spektrofotometrie: spektrometr se dvěma monochromátory, které skenují simultánně s rozdílem Δλ= 1 až 5 nm. Dva monochromatické paprsky procházejí střídavě kyvetou (rotující sektor, zrcadlo). Derivační spektrofotometrie Tvorba derivačních spekter 3) Matematicky: v současné době nejvíce používáno Aproximace 1. derivace: polynom, Savitzky-Golay