Molecular Ecology Co je molekulární ekologie? Uměle vytvořený obor vymezený technickým přístupem. Na ekologické problémy hledá odpověď pomocí molekulárních metod. (Zoologové a botanici nakoupili cyklery a sekvenátory, snažili se je využít i k něčemu jinému než je taxonomie => vznikla molekulární ekologie) Pracuje na různých úrovních variability DNA (genom, jedinec, populace, skupina populací) Je to vlastně aplikovaná populační genetika Proč? Proč používat molekulární metody v ekologii? n Často nelze jinak n paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození n identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů n izolace populací – nemusí být zřejmá n počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince Její význam vzrůstá ... n Je překvapivě kompaktní n Je populární - Molecular Ecology (od 1992) – dnes 24 čísel za rok n ISI Journal Citation Reports® Ranking - 2006: 6/114 in Ecology; 5/34 in Evolutionary Biology; 55/262 in Biochemistry & Molecular Biology; Impact Factor: 4.825 n Vyšly i její učebnice n Na řešení velmi odlišných problémů používá obdobné metody n Snad se dá tedy i přednášet ... Vychází z populační genetiky n Slavní zakladatelé moderní syntézy, třicátá léta n Matematické modely spojující genetiku a evoluční teorii Obsah přednášky n Příbuznost (neutrální znaky) u identita (stopy stejného jedince, klony) u paternita, vzdálenější příbuzní u vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) u fylogeografie (historie šíření) u hybridizace, hybridní zóny n Geny pod selekcí u MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny u geny pro zbarvení n Ochranářská genetika Technické výlety n PCR n Mikrosatelity n Mitochondriální DNA n Transposony n DNA arrays n DHPLC n Fylogenetické metody Organismy ü Diploidní s pohlavním rozmnožováním ü Většinou obratlovci ü Budou ale i třeba motýli nebo slávky ü Rostliny fungují často jinak! Ale určitě i o nich bude řeč. Příbuzné přednášky, tj. co se zde objeví jen okrajově? n M. Macholán a kol. - Genetické metody v zoologii n M. Macholán - Evoluční biologie n J. Zukal – Behaviorální ekologie n S. Pekár – Ekologie populací n aj. (molekulární ekologie „prorůstá všude“) Úrovně variability DNA n druh – fylogenetické analýzy (fylogenetická systematika, identifikace druhů) Úrovně variability DNA n populace – studium speciace, fylogeografie Úrovně variability DNA n populace – populační biologie, ochranářská genetika) Úrovně variability DNA n jedinec – analýzy příbuznosti (behaviorální ekologie, např. analýzy paternity) Genetické markery n Coding DNA (genes) n transcribed sequences n genetic code n phenotype n natural selection n increasing importance in molecular ecology n Non-coding DNA n not functional (not known function) n neutral to natural selection n majority of DNA in eukaryotes n pseudogenes n repetitive DNA Repetitive DNA Coding (functional) DNA n study of selection n codon third position is highly redundant and is not under selection • ribosomal DNA • nuclear structural (protein coding) genes • mitochondrial DNA 1. Ribosomal DNA 2. Nuclear structural genes n low individual variation – important function (not very often used in molecular ecology) – allozymes n MHC variation n SNPs – renewed interest in nuclear structural genes 3. Mitochondrial DNA „Molekulárně-genetické“ metody n analýza polymorfismu DNA n konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») n sekvenční polymorfismus: „Molekulárně-genetické“ metody n analýza polymorfismu DNA n konzervativní vs. variabilní úseky (« loci ») n sekvenční polymorfismus n délkový polymorfismus Vznik DNA polymorfismu n mutace (transice, transverze, inzerce, delece) n rekombinace (kombinace změn vzniklých mutacemi, duplikace a delece při rekombinačních chybách) n transpozice n Þ general molecular biology Genotypizace – stanovení genotypu n stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) • izolace celkové DNA z tkání • amplifikace požadovaného úseku DNA (PCR) • studium variability daného úseku (lokus) Izolace DNA n rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA n dnes většinou komerční kity n velký vliv fixace vzorků Fixace materiálu n čerstvá tkáň n čistý EtOH n rychlé vysušení n speciální extrakční pufry n zamražení n formaldehyd n opakované zamražování n rozvlhčování sušeného materiálu n další fixační média Amplifikace DNA – PCR PCR n Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. n Co se bude množit? To určí primery. n Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. Denaturace (obvykle 95°C) při zvýšení teploty se oddělí komplementární vlákna DNA Primery přidané v nadbytku kmitají díky Brownově pohybu Při ochlazení primery přisednou rychleji než dojde k vzájemné reasociaci dlouhých vláken DNA (obvykle 50 - 65°C) – „annealing“ Primery jsou prodlužovány přidáváním nukleotidů podle sekvence templátu (obvykle 72°C – optimum pro Taq polymerázu) Při dalším zahřátí dojde k oddělení templátu a nově vzniklých vláken Po ochlazení primery přisednou na templát i nově vzniklé fragmenty („annealing“) Při 72°C dojde opět k prodlužování primerů a vzniku nových kopií Při dalším zahřátí… PCR Co když PCR nefunguje? n Měníme teplotu „annealingu“ (nejlépe použijeme gradient teplot, pokud to náš cykler umí) Vyšší teplota=vyšší specificita n Měníme koncentraci Mg^2+ iontů n Navrhneme nové primery Studium variability nasyntetizovaného úseku • délkový polymorfismus n elektroforéza Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti n Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) n Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) n Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) Studium variability nasyntetizovaného úseku • sekvenční polymorfismus n +/- analýza (elektroforéza) n sekvencování n SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza