History • již první studie genetického polymorfismu ® genetické techniky mohou rozlišit nejisté otcovství ® jedno z hlavních témat molekulární ekologie • chromosomal polymorphism • allozyme electrophoresis • DNA fingerprinting – overturn of existing paradigms in behavioural ecology (birds) • statistical techniques for single-locus polymorphism (allozymes) – departure from practice (i.e. DNA fingerprinting) History Využití mikrosatelitů (dnes nejčastěji používané markery pro stanovení paternity) • Spojení teorie (statistické modely) a praxe (vysoce polymorfní single-locus markery) • Tandemová opakování krátkých motivů • Např. (CTTT)[n ]nebo(CA)[n ] • Vysoce polymorfní • Jednoduchá dědičnost • found in many species (probably common) Alely se liší délkou – analýza dvou jedinců Proteinový fingerprinting • Hohol severní Andersson & Åhlund 2000 • Proteiny z bílku vajec • isoelectric focusing in immobilized pH gradients • Vnitrodruhový hnízdní parazitismus (více něž polovina hnízd) • Zanáší si zřejmě příbuzné samice Statistical methods of parentage analysis • Exclusion nekompatibilita mezi rodičem a potomkem ® zamítnutí rodičovství • Categorical and fractional likelihood nelze vyloučit více jedinců • Parental reconstruction z genotypů potomků z jedné rodiny rekonstrukce genotypu rodičů srovnání se skupinou potenciálních rodičů nebo srovnání navzájem mezi potomky k určení „multiple paternity“ Určení paternity – exclusion principle Fragmentační analýza Kolik je třeba lokusů? • Nutný počet není absolutní • Dáno: ü počtem alel ü heterozygotností ü četností alel ü velikostí vzorku • ideální - hypervariabilní lokusy stačí třeba jen 3 • Tedy nejdříve je nutná pilotní studie dospělců v populaci • → výpočet Exclusion probability Exclusion probability • Pravděpodobnost, že genotyp náhodně vybraného jedince nebude pasovat na potomka • Závisí na počtu lokusů a alel • Jiné hodnoty pro prvního a druhého rodiče • Dobré jsou hodnoty okolo 0,99 • Vypočítá například Cervus Exclusion - complications • Mendelian rules of inheritance: genotyping errors, null alleles, mutations ® false exclusions in strict conditions • Extended family structure (příbuznost potenciálních rodičů) – nejhorší jsou sourozenci • Linked loci – decrease of variation • Loci on sex chromosomes • problems increase with increasing number of individuals and loci • very usefull for experiments where all possible parents are known Mutace Ibarguchi et al. 2004 • Obvykle se zanedbávají • Mohou však být i poměrně časté – vysoká mutační rychlost mikrosatelitů (4.5 x 10^-2 - 5.1 x 10^-6 na lokus) • Navíc častější u samců (2 až 6x) • → Vyloučení na základě jednoho lokusu může být špatně !!! Řešení • Použít více lokusů • Probability of resemblance (P[R]) Podívám se na ostatní lokusy a vypočítám s jakou pravděpodobností mohou alely sdílet dva nepříbuzní jedinci. Uria lomvia • 22% mimopárová paternita bez korekce na mutace • 7% mimopárová paternita s korekcí soulad s jinou použitou technikou Categorical x fractional likelihood • likelihood scores derived from progeny and nonexcluded parents genotypes • Categorical l.: potomek jako jednotka přiřazen otci, biologicky validní • Fractional l.: potomek přiřazen všem kompatibilním otcům. Statisticky přesnější a proto někdy výhodnější (f.e. better for comparing the reproductive success of different categories of males) Categorical allocation • identifying one parent when the other is known • identifying one parent with no information about the other parent • identifying a parental pair starting with no prior information Fractional allocation • assigns some fraction (between 0 and 1) of each offspring to all nonexcluded candidate parents • the portion of an offspring allocated to a particular candidate parent is proportional to its likelihood of parenting the offspring compared to all other nonexcluded candidate parents Megaptera novaeangliae Nielsen et al. 2001 • Až 25 samců se pokouší pářit se samicí • Různé role samců - dominantní společník a vyzyvatel, sekundární společníci • 6 mikrosatelitových lokusů • Fractional likelihood paternity method • Dominantní samci mají asi 3x více mláďat (je to ale neprůkazné) Categorical and fractional likelihood - disadvantages • male’s likelihood of paternity is positively related to his homozygosity (homozygotes have higher likelihood to have the same allele with the progeny) ® be carefull when estimating variance in reproductive success • categorical – overestimate the reproductive success of homozygotes and underestimate that of heterozygotes • fractional – a priori equal probability of paternity (required by the technique) underestimates variance in reproductive success Genotypic (parental) reconstruction • reconstruction of parental genotypes from progeny arrays of full- or halfsibs • exhaustive algorithm • extremely computationally intensive • most often in fish parentage Choosing the method • sampling of unknown parents (all, some, none) • sampling large groups of full- or halfsibs (yes, no) • a priori known parents (both, one, neither) Počítačové programy • Cervus, Newpat, Probmax, Kinship, Famoz, Papa, Parente, Patri, Gerud • available online – see Jones & Ardren (2003) • the most important differences – handling sources of difficulty (null alleles, mutations, scoring errors) Co je nejdůležitější? • Kvalitní data z terénu! • Nejlépe všichni dospělci z populace, behaviorální a jiná fenotypická data, mláďata přiřazena do rodin (matka + sociální partner) • Špatná data = špatné výsledky Stane se, že nemohu získat vzorky všech dospělých jedinců z populace (potenciálních rodičů) nebo nelze říci, která mláďata jsou z jedné rodiny • Nemusí se zdařit najít rodiče všem potomkům • I tak ale mohu zjistit ledacos zajímavého (multiple paternity) Příklad genotypy matky a embryí lokus 1 lokus 2 Matka 100 150 300 350 1. embryo 100 115 300 320 2. embryo 150 120 350 310 3. embryo 120 100 350 365 Alely od matky lokus 1 lokus 2 Matka 100 150 300 350 1. embryo 100 115 300 320 2. embryo 150 120 350 310 3. embryo 120 100 350 365 Na druhém lokusu více než dvě alely, které nejsou od matky → více otců Apodemus agrarius mláďata až od tří samců Orangutan na Sumatře (paternity) • Nápadný dimorfismus (vystouplé tváře a hrdelní vaky u samců) • Předpoklad: Samci bez nápadných znaků hormonálně suprimováni a nemnoží se • Mikrosatelity – 50 % mláďat je od samců bez nápadných znaků → alternativní strategie Lepomis (maternity) • Samec (bourgeois male) hlídá hnízdo s jikrami • L. marginatus, L. punctaus, L. auritus samec má v hnízdě jikry od několika samic • L. macrochirus tři typy samců (alternativní reprodukční strategie): bourgeois (> 7 let, staví hnízda) mladí samci (vjíždějí do hnízd a vypouštějí spermie) nespárovaní staří samci (napodobují samice) 20% potomků není od bourgeois Skladování spermií • Dny u savců týdny u ptáků nebo hmyzu měsíce u mloků roky u hadů a želv • Chrysemys picta mikrosatelity → po 3 roky mláďata od stejného otce, opakované páření se stejným otcem je nepravděpodobné Ptáci • Řada druhů považována za monogamní (pěvci) • Ale u 75 % druhů ptáků mimopárová mláďata • Skutečně monogamní pěvci – jen 14% (Phylloscopus) Odhad % mimopárových mláďat • Dostatečný vzorek pro odhad • Více než 200 Halichoerus grypus tuleň kuželozubý Wilmer et al. 1999 • Samci z centra kolonie úspěšnější (až 30x) • Samci reprodukčně aktivní 10 let i déle • Pro více než polovinu mláďat nenalezeni otci → role páření ve vodě • Kolonie, dimorfismus→ polygynie • Dvě skotské kolonie North Rona a Isle of May • Vzorky ze zhruba deseti let • 9 mikrosatelitových lokusů • IDENTITY, NEWPAT, CERVUS Příklad: Maternita a paternita u netopýrů