Molekulární identifikace jedinec, pohlaví Identifikace jedince - metody • DNA fingerprinting (název dnes používán pro různé metody) - velké množství kvalitní DNA - technická náročnost +univerzalita • AFLP (RAPD) - kvalitní nedegradovaná DNA +univerzalita • Sekvenování, alozymy - nemusí rozlišit jedince • Mikrosatelity + stačí malé množství nekvalitní DNA, optimální pro neinvazivní přístupy - je nutné znát konkrétní lokusy a sekvence specifických primerů RFLP a AFLP • Základem je naštípání DNA restrikčními enzymy • → milióny fragmentů různé délky • Rozdíly díky: – přítomnosti/absenci restrikčních míst – tandemovým opakováním (mikrosatelity, minisatelity) – delece a inzerce • Zviditelnění jen určité části fragmentů DNA fingerprinting • Jeffreys et al. 1985 – „naštípání“ DNA pomocí restrikčního enzymu – Rozdělení fragmentů pomocí elektroforézy – Hybridizace (jako sonda minisatelit, např. Alu) • Dostatek kvalitní DNA • Vše na jednom gelu • Laboratorní náročnost AFLP • Naštípání DNA restrikčními enzymy • Navázání adaptérů • Amplifikace primery o nukleotid delšími než je adaptér (jinak sekvence komplementární k adaptéru) • Amplifikace primery o nukleotid delšími než je adaptér (jinak sekvence komplementární k adaptéru) • Amplifikace značenými primery o 3 nukleotidy delšími než je adaptér • Detekce – gely, sekvenátor mikrosatelity • Tandemová opakování krátkých motivů • Izolace DNA • PCR • Detekce → sekvenátor, fragmentační analýza Identifikace jedinců závisí na stupni polymorfismu • multilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P[(ID)]) (Waits et al. 2001) Medvědi v Pyrenejích Taberlet et al. 1997 • Trus a chlupy • 24 mikrosatelitových lokusů • 4 samci a jedna samice (o jednoho víc než podle stop a fotografií) • Riziko „allelic dropout“ (u heterozygotů detekce jen jedné alely → falešní homozygoti) • Multiple-tube approach, mnohonásobné opakování PCR reakcí Lidská forenzní genetika • Pozůstatky vojáků z války Vietnam a Korea Identifikace na základě mtDNA příbuzných osob (lze jen někdy) V současnosti: vzorek DNA (krve) při odvodu, jiné markery Armed Forces Repository of Specimen Samples for the Identification of Remains • Soudní pře Clinton-Lewinská Pozůstatky ruského cara Nikolaje II • Kriminalistika • Oběti tragických událostí Klony Bambus Sasa senanensis • Suyama et al. 2000 • Plocha 10 hektarů • AFLP • 22 klonů • Klon na ploše 300 m v průměru Slavní klonální bezobratlí • Rotifera – Bdelloidea • Ostracoda (Darwinula) • Partenogenetické klony vysokého stáří (milióny let) Genetické chiméry • organismy složené z buněk s různými genotypy • Dictyostelium discoideum chimérismus je pravidelná součást života Genetické chiméry • Ficus srůst kořenů různých jedinců • Botryllus schlosseri chimérické kolonie příbuzní jedinci • Diplosoma listerianum i nepříbuzní Celleporella hyalina (Bryozoa) Hughes et al. 2004 • Pravděpodobnost fůze koreluje s příbuzností • Histokompatibilita • Lepší rozpoznávání v pokročilejších fázích → dozrávání imunokompetence • Specielní proteiny (spongikany...) Genetické chiméry • Callithrix jacchus (asi i Saguinus) • Dizygotická dvojčata • DNA fingerprinting krve • Jsou to hematopoietické chiméry • Během embryonálního vývoje vzájemná výměna buněk kostní dřeně • Týká se to asi jen krve (neinvazivní metody – chlupy, trus →jeden genotyp) • Průnik embryonálních erytroblastů a volné DNA přes placentu u člověka • (pohlaví dítěte před narozením lze určit i pomocí PCR sekvencí typických pro Chr Y, jako templát periferní krev matky) Genetická identifikace pohlaví • druhy s nevýrazným pohlavním dimorfismem (ptáci) • zárodky v ranném stádiu ontogeneze (embrya) • neinvazivní metody (trus, skořápky, šupiny) Genetická identifikace pohlaví • druhy s genetickou determinací pohlaví (tj. nejčastěji pohlavní chromozómy) • ptáci (♂=ZZ, ♀=ZW) • savci (♂=XY, ♀=XX) • amplifikace DNA oblasti specifické pro heterogametické pohlaví • W, Y – malé chromozómy Určení pohlaví – ptáci Griffith et al. 1998 • CHD1W a CHD1Z, geny na pohlavních chromosomech (chromobox-helicase-DNA-binding gene (CHD) – Griffiths & Tiwari 1995) • Primery amplifikují introny obou genů • Introny se mohou lišit délkou • Existují už tři možnosti běžně používaných primerů • Problematické druhy Struthioniformes Manorina melanocephala (Meliphagidae) Arnold et al. 2001 • Synové fungují jako pomocníci • U adultů 2,31 samců na 1 samici • Mláďata v hnízdě poměr pohlaví 1:1 (57:57) • První se líhnou samci (v 17 hnízdech z 18) Při opouštění hnízda jsou větší a těžší Určení pohlaví - savci • Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • Sry DNA-binding motif (HMG box) velmi podobný u vačnatců i placentálů • Microtus cabrerae Sry na Chr X Ellobius, Tokudaia Sry zcela chybí Určení pohlaví - savci • Amplifikace genu na Chr Y (Sry) (nejlépe duplex PCR s genem na X nebo autosomech) • Sry DNA-binding motif (HMG box) velmi podobný u vačnatců i placentálů Určení pohlaví – jiné skupiny • Chr Y občas i u rostlin Rumex • Plazi Calotes versicolor Sry má i 50% samic! • Hledání markerů pomocí nespecifických metod (RAPD, AFLP)