Ochranářská genetika aneb co nám může molekulární ekologie napovědět o životaschopnosti populací Ochranářská genetika („conservation genetics“) n Využití genetických metod v ochranářské biologii – součást tzv. molekulární ekologie n Pracuje na různých úrovních variability DNA – nejčastěji ale na úrovni populací n PCR (90. léta) – počátek skutečné ochranářské genetiky (neinvazivní metody - již není potřeba destruktivního vzorkování) n od r. 2000 - Conservation Genetics (IF = 1.784) n recentní review a knihy n European Science Foundation – program ConGen Cíle přednášky n Základní principy a metodické přístupy n Praktické aplikace a problémy n Budoucnost ochranářské genetiky Metodické přístupy 1) Populační genetika n studium struktury populací n nejčastěji neutrální znaky - mikrosatelity [n ]efektivní velikost populace N[e] n tok genů (sex-specific) n „past bottleneck“ n původ jedinců („assignement tests“) n příbuzenské křížení (inbreeding), atd. n „founder contribution“ Bayesiánské analýzy (např. program STRUCTURE, GENELAND aj.) - identifikace subpopulací („management units“), - identifikace hybridů - identifikace geografických bariér toku genů Ne – effective population size n velikost ideální populace (náhodné páření, rovnoměrný poměr pohlaví), která ztrácí genetickou diverzitu stejnou rychlostí jako aktuální populace n ovlivněna genetickou a věkovou strukturou, poměrem pohlaví, intenzitou inbreedingu atd. n vývoj genetické variability v malých populacích závisí na N[e] více než na N n N[e]/N » 0.11 (Frankham 1995), ale velká variabilita Odhady Ne n F[ST] = 1/(4N[e].m +1) n recentní přístup: coalescent theory methods n TMVP (Beaumont 2003) n CoNe (Anderson 2005) n MLNE (Wang and Whitlock 2003) n MSVAR (Beaumont 1999) TMVP 2) Fylogeografie n použití fylogenetických metod na úrovni populací (nejčastěji sekvence mtDNA, jaderné markery jsou málo polymorfní) n původ populací, jejich stáří a historické vazby n detekce ESU („evolutionary significant units“) – lokální adaptace (mohou, ale nemusí) n důležité pro reintrodukce Příklad: Castor fiber , sekvence CR mtDNA Durka et al., Mol.Ecol, 14: 3843-3856 (2005) 3) Speciální přístupy n škodlivá (detrimental) variabilita – detekce inbrední deprese n identifikace adaptivní variability – lokální adaptace n experimentální ochranářská genetika (zejména hmyz a rostliny) n neinvazivní genetické metody Inbreeding a fitness n Nárůst proporce homozygotů - efekt škodlivých recesivních alel n Inbrední jedinci by měli mít nižší fitness (reprodukční úspěch nebo schopnost přežívat) n Známo z laboratorního křížení (extrémní příklady) n Studium v přírodě je obtížné - malé populace, nebo po projití hrdlem lahve „Bottleneck“ efekt n Druhy s výrazným snížení genetické variability - prošly hrdlem lahve n Prokázané snížení variability (mtDNA, alozymy) – random drift n gepardi - snížení o více než 90 % n přesto se počty výrazně zvedly n „purging“ – odstranění škodlivých alel v důsledku zvýšené selekce na homozygoty n fixace škodlivých alel – Florida panther Florida panther n cryptochordism, poruchy vývoje ocasních obratlů, srsti a spermií – téměř fixovány genetickým driftem n pozitivní i negativní dopady introdukce teoreticky testovány (Hedrick 1995) n introdukce osmi pum z Texasu – v následující generaci bylo 20 % genetické informace z Texasu n ocas – 7 % vs. 88 % n srst – 24 % vs. 93 % n cryptochordism – 0 % vs. 68 % Adaptivní variabilita n rozdílná prostředí → diverzifikující selekce → lokální adaptace n outbrední deprese – narušení lokálních adaptací (důležitá při reintrodukcích) n analýza funkční genetické variability – min. 9 přístupů (review in Vasemägi & Primmer 2005) n genomika, proteomika, transkriptomika n např. neutrality tests, genome scans, cDNA microarrays, QTL atd. King and Wilson 1975 Science paper by King and Wilson 1975 n “all the biochemical methods agree that the genetic distance between humans and chimpanzees is probably too small to account for their substantial organism differences” n “evolutionary changes in anatomy and way of life are more often based on changes in the mechanisms controlling the expression of genes than on the sequence changes in proteins” n Dnes: člověk a šimpanz - 98.7% identita genomu, výrazné tkáňově-specifické rozdíly v expresi, zejména v mozku (Enard et al. 2002) Study transcriptomics n Study expression of single genes – quantitative real-time PCR - známý kandidátní gen (modelové druhy) n Study expression of multiple genes (genomic scale) - microarray - identifikace kandidátních genů – detekce jejich exprese může podat důležitou informaci o jeho funkci (různá v odlišném prostředí, vývojovém stadiu, stresu atd.) - geny zahrnuté do stejného procesu mohou mít stejnou expresi (co-regulated genes) Experimentální ochranářská genetika n rekonstrukce historických procesů v laboratoři n testování hypotéz n ztráta genetické diverzity v malých populacích n síla selekce a genetického driftu v malých populacích n význam environmentálního stresu na expresi funkčních genů n efekt inbreedingu na přežívání n apod. n modelové organismy – převážně hmyz a rostliny Př.: Vztah inbreedingu a teploty Non-invasive genetic methods in conservation genetics n by definition „conservation of rare and endangered animals“ – not possible to kill or even disturb them n need of methods allowing collection of genetic data without direct contact Ø non-invasive genetic methods Three different DNA sampling methods Sources of DNA - faeces Sources of DNA – hairs n follicles n hair traps with glue patches n more hairs –risk of mixed samples Sources of DNA – feather samples Sources of DNA - others n urine – rarely used (Hausknecht et al. 2006 and references therein) n more material available than faeces (urination rates – six time higher than defecation frequencies n wolves – 33 samples with positive DNA concentration – 14 (42%) congruent results for all loci ... artificial „bug-eggs“ Tracking of the endangered Pyrenean brown bear population n hair and faeces n 24 microsatellite loci n one yearling, three adult males, one adult female n spatial activity n suggestions for conservation management Identification of species n mtDNA – many copies in one cell Identification of sex n sexual structure of population n genetically determined sex n markers: mammals – SRY, amelogenin; birds – CHD n species-specific markers must be used (otherwise cross-amplification with species in the diet) Identification of individuals n multilocus microsatellite fingerprinting – power estimated as „probability of identity“ (P[(ID)]) (Waits et al. 2001) Identification of individuals n spatial activity Non-invasive CMR studies n population size n „capture-mark-recapture“ - review in Lukacs & Burnham (2005) n repeated sampling of the same animal n survival rate, capture rate (amplification success), recruitment etc. n closed population models, open population models, Robust design models n corrections for genotyping errors Brown bears (Ursus arctos) in Scandinavia (Hakon Solberg et al. 2006, Biological Conservation) Population genetics n genetic structure of populations [n ]effective population size N[e] n gen flow (often sex-specific) n identification of past bottlenecks n origin of migrants („assignment tests“) n detection of inbreeding n founder contribution n „management units“ n hybrids n gene flow barriers Adaptive variation of populations n MHC („major histocompatibility complex“) variation – PCR and SSCP n comparison of MHC and neutral (microsatellites) variation – detection of contemporary selection n faeces – parasitological examination – correlation between MHC and parasite prevalence Disadvantages and their solutions n low quality and/or quantity of DNA – low success rate of genotyping and high contamination risk n identification of crucial factors of succesfull analysis n avoiding of genotyping errors and contamination Increase of genotyping success rate n multi-samples, multi-extracts (Goosens et al. 2000) n PCR - multiple-tubes approach (Taberlet et al. 1996) n cost and time-consuming n pilot studies are reasonable Genotyping errors I. n allelic drop-out n very low concentration of DNA in samples - only one allele in heterozygotes is amplified Genotyping errors II. n false alleles n PCR artefacts – rarely replicated when using „multiple-tubes“ approach Increase of DNA concentration n pre-amplification (Bellemain & Taberlet 2004) n quantitative PCR (Morin et al. 2000) Effect of locus Influence of diet on faecal DNA amplification n poorly known n Murphy et al. 2003 – brown bears n salmons in the diet – significant decrease of amplification success n herbivores – better results than carnivores Effect of sample type and temperature n otters – fish eating carnivores n effect of sample type: anal gelly (82%) vs. faeces (34%) in frozen faeces of otters n effect of temperature n very quick degradation of DNA Effect of PCR inhibitors (faeces) n many inhibitors in faeces (products of digestion, chemicals in plants) – addition of special reagents (BSA), hot-start etc., dilution of template etc. High contamination risk n avoiding of „laboratory“ contamination (tips with filters, separated pre- and post-PCR laboratories, UV sterilisation, etc.) n „mixed samples“ – problems in social species (communal latrines, marking in fixed sites) or in sampling at broad intervals („hair traps“) – usually identified by 3 or more alleles/sample; problem in species with low genetic variability n primates – contamination with human DNA Otters in central Europe n strong decline of population numbers in last century n fragmentation of distribution area Aims: n estimate population numbers from faeces n population genetic analysis – identification of gene flow barriers, Ne, bottlenecks etc. n spatial activity in different habitat types and relatedness of individuals Methods and results n succesful identification of otter faeces by multiple-tube approach (more than 20000 PCRs - Hájková et al. 2006) – sample type and temperature are most important factors n individual identification – abundance is much higher in fishpond areas than in mountains n Czech and Slovak populations are genetically separated (F[st] = 0.15) n evidence for recent bottleneck 15-30 years ago (Bottleneck, MSVAR) (Hájková et al. 2007) n analyses of spatial activity and relatedness (Zemanová 2006) Map of study area with identified otter individuals Diet of the extinct Ground Sloth (Nothrotheriops shastensis) n Poinar et al. (1998) – Science n 20 000 years ago n chemical modification of DNA in ancient faeces before PCR n identification of species and phylogeny to modern mammals n cpDNA – diet of the Ground Sloth Badger hair in luxury shaving brushes n 4 brushes from 8 came from the Eurasian badgers n 3 of them from the Netherlands where it is illegal to possess, sell, transport or use for commercial purposes dead European badgers or products derived from them Praktické problémy ochranářské genetiky n mladé odvětví = mnoho problémů n význam genetické variability pro životaschopnost populací n extrémní neznalost adaptivní variability u volně žijících druhů (MHC apod.) n identifikace ochranářských jednotek (ESU, MU apod.) na základě genetických dat → praktická ochrana n neinvazivní metody – nutno snížit ceny a zvýšit přesnost – optimalizace počtu analyzovaných znaků pomocí počítačových simulací