Expressed genes and natural selection Functional gene products and their importance in ecological studies Genetic markers • Coding DNA (genes) • transcribed sequences • genetic code • phenotype • natural selection • Non-coding DNA • not functional (not known function) • neutral to natural selection • majority of DNA in eukaryotes • pseudogenes • repetitive DNA Expressed DNA segments - genes • strict nucleotide structure (see Molecular biology) • exons and introns, START and STOP codons etc. • transcription + translation  phenotype • oligogenes – qualitative traits (f.e. homeotic genes, Wnt ligands) Why genes in molecular ecology? • functional importance – genetically determined variation • gene products are not visible by standard ecological methods, but play a significant role in ecology, evolution and behaviour of animals • it is necessary to use molecular methods to identify their variation • expressed genes are selected by natural selection • increasing importance in zoological and ecological studies (vs. neutral variation – mtDNA, microsatellites etc.) Metody studia funkční variability • Sledování kandidátních genů • Genomické přístupy (mnoho genů najednou) pytlouš Chaetodipus intermedius Hoekstra, Nachman et al. • Tmavé a světlé zbarvení • Odpovídá barvě prostředí (tmavé zbarvení na lávě) • Arizona • Korelace zbarvení s prostředím i na malé škále • mtDNA nekoreluje se zbarvením • Sekvenování kandidátních genů (známých z inbredních myší) • melanocortin-1 receptor MC1R • Záměna 4 aminokyselin • Jednoduchá dědičnost alel a zbarvení MC1R u člověka, mamuta a dalších • U člověka zrzavé vlasy a neschopnost se opálit • Zbarvení krav, koňů a psů • Výskyt dvou odlišných variant u mamutů MUPs Paraziti Paraziti / patogeny Buňky imunitního systému Struktura MHC (major histocompatibility complex) Funkce MHC: rozeznání a prezentace cizorodého antigenu Funkce MHC: rozeznání a prezentace cizorodého antigenu Genetic structure of MHC Functional categories of genes within MHC • Antigen processing and presentation (Class I and Class II genes, TAP etc. • Innate immunity, inflammation, regulation of immunity (Class III genes, such as C4, C2, cytokines, TNF, etc.) • Intercellular interactions via MHC receptors and ligands (notch, tenascin, class I and II) • Functions unrelated to immunity Comparative genomics Duplication blocks MHC in other species MHC in birds MHC in all vertebrates? Antigen binding site (ABS) ABS – většina variability Jak zajistit rozpoznání obrovského množství patogenů? • Vysoká alelická variabilita – více než 200 popsaných alel na DRB genu u člověka • Rekombinace – uvnitř genů i mezi geny • Genové duplikace – druhově specifické – Class I: až 17 genů u cichlid vs. max. 3 geny u lososovitých ryb Complex MHC polymorphism Jak zjistit, že je gen pod selekcí? dN/dS • Poměr nesynonymních (dN) a synonymních (dS) mutací • Alignment sekvencí stejného genu u více druhů → rozdíly (mutace) → jen některé mutace změní aminokyselinu • Korekce (rozdílné metody, MEGA, PAML) jen 25 % možných záměn nezmění aminokyselinu některé typy mutací častější zpětné a konvergentní mutace (hlavně u více odlišných sekvencí) • Většinou dN/dS << 1, selekce eliminuje změny, „purifying selection“ protein se nemění • dN/dS >> 1 „positive selection“ - MHC • Různé části proteinu mohou být pod různou selekcí Důkaz a mechanismus recentní selekce • Srovnání populačně-genetické struktury na MHC genech a neutrálních znacích (mikrosatelity) • Asociace MHC genů a výskytu parazitů • Srovnání populačně-genetické struktury na MHC genech a neutrálních znacích (mikrosatelity) Studované lokality – 7 populací ve stejné fázi populačního cyklu Diferenciace populací v průběhu růstu denzity Isolation by distance Detekce „outliers“ - populace 07 vs. ostatní Závěr: Typ selekce na MHC závisí na početnosti populace Jaké jsou mechanismy přírodního výběru pro udržení vysoké variability MHC? • Hypotéza výhody heterozygotů – mají 2x více alel než homozygoti, tj. mohou rozeznávat 2x více patogenů • Výhoda vzácné alely (= selekce negativně závislá na frekvenci) Výhoda heterozygotů Výhoda vzácné (výhodné) alely • Dynamická koevoluce mezi hostitelem a parazitem Výhoda vzácné (výhodné) alely Výhoda vzácné (výhodné) alely Výhoda vzácné (výhodné) alely • Dynamická koevoluce mezi hostitelem a parazitem • Asociace mezi MHC alelou (alelami) a intenzitou napadení parazity (hlodavci, lemuři – 2005 a novější) nebo přežíváním při bakteriální infekci (lososi) Vícerozměrné analýzy Parazitologická data – PCA Analýza koinercie (co-inertia analysis) Výběr partnera a MHC Hypotézy pohlavního výběru podle MHC A) Výběr partnera s odlišným MHC – „inbreeding avoidance hypothesis“ • MHC = „komplementární geny“ Hypotézy pohlavního výběru podle MHC B) Výběr partnera, který nemá parazity (tj. není nemocný) • MHC = „dobré geny“, které lze „cítit“ Hypotézy pohlavního výběru podle MHC C) Výběr nejlepšího partnera, který nemá parazity, ale má ještě „něco navíc“ • MHC = „dobré geny“, umožňující expresi sekundárních pohlavních znaků Gasterosteus aculeatus Milinski et al. (2001-dosud) • Nedávno duplikované MHC class IIB geny • Nejvíce jedinců má střední počet alel • Střední počet alel = minimum parazitů • ♀♀ „počítají“ vlastní počet alel a vybírají si ♂♂ tak aby optimizovali počet alel u potomstva • Výběr je ovlivněn strukturou komplexu MHC-peptid Methods for MHC analyses • Identification of allele sequences – cloning and sequencing methodology Cloning and sequencing - separation of two (or more in duplicated genes) alleles Methods for MHC analyses • Identification of allele sequences – cloning and sequencing methodology • Population screening – methods for mutation detection (TGGE, DGGE, SSCP – gel and capillary variants) Denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) Many samples in one gel – we will not see any curves Single strand conformation polymorphism (SSCP) The use of automated sequencers Why not non-denaturing electrophoresis? Methods for MHC analyses • Identification of allele sequences – cloning and sequencing methodology • Population screening – methods for mutation detection (TGGE, DGGE, SSCP – gel and capillary variants) • DNA vs. cDNA analysis !!! (cDNA analysis is more rigorous due to common existence of pseudogenes) Kam dál ve výzkumu MHC v evoluční ekologii? • zvýšit počet studií na divokých populacích (s údaji o parasitech, neutrální genetické variabilitě, údaje o kondici zvířat atd.) • experimenty v zajetí s jedinci se známým MHC genotypem (a sledování vlivu na přežívání a reprodukční úspěšnost) • genomika, transkriptomika, proteomika – popis „skutečné“ MHC variability Vrozená nebo získaná imunita? Yersinia pestis • První obrannou linii tvoří specifické receptory, které nejsou součástí adaptivní imunity • Tyto receptory jsou vrozené a připravené „v předstihu“ = „vrozená imunita“ Ekologický a evoluční kontext vrozené imunity Minimum údajů o TLRs a dalších součástech vrozené imunity u volně žijících živočichů !!! • velký rozvoj imunogenetického výzkumu volně žijících populací v současnosti • komplexní studium genetické struktury a exprese nejrůznějších složek imunitního systému může významně přispět k pochopení evoluce a ekologie současných obratlovců Sledování mnoha genů najednou Sledování exprese genů microarrays • Sledování exprese mnoha (tisíce) genů najednou • Založeno na hybridizaci • Sleduje se rozdíl vůči kontrole Populus trichocarpa x deltoides a Malacosoma disstria bourovec Ralph et al. 2006 • cDNA microarray • 15496 genů > ݯenomu • Po 24 hodinách 1191 genů up-regulated 537 down-regulated • Obrana: endochitinázy, inhibitory proteáz • Signální funkce • Transport, metabolismus, regulace transkripce Závěr • Molekulární ekologie se rychle vyvíjí • Metody se zásadně vylepšují a mění • Co platilo dnes, nemusí platit zítra • Těšme se tedy na zítřek • A hlavně je třeba číst!