Cvičení 7 Strukturální barvení bakteriálních pouzder a endospor V tomto cvičení využijeme dvou typů barvení. Bakteriální spory špatně přijímají barvivo (vzhledem k rigidnímu špatně propustnému obalu), proto se obarví až během varu v daném barvivu (stejně jako např. acidorezistentní bakterie – Mycobacterium, které bychom Gramovým barvením neobarvili vzhledem k obsahu lipolytických látek mykolových kyselin). Bakteriální pouzdra zase v okolí buněčné stěny zvýrazníme tím, že negativním barvením obarvíme okolí buněk, nikoli buňky samotné a tím získáme i zvýraznění pouzder. Samotná pouzdra lze barvit horkým karbolfuchsinem. Bacillus megaterium – zelené spory obarvené varem v malachitové zeleni Textové pole: Pouzdro azotobaktera – negativní barvení Bakteriální spory: - termorezistentní endospory jsou klidová (tedy nereproduktivní) stadia převážně grampozitivních bakterií; jsou velmi odolné a charakteristické minimálním obsahem vody a minimálním metabolismem - sporulují i gramnegativní bakterie, poté se spory nazývají exospory (a vznikají jiným způsobem. Vyjímečně tvoří endospory i gramnegativní bakterie, např. Coxiella burnetti, původce Q-horečky - důvodem sporulace je adaptace či příprava na změny podmínek životního prostředí (nikoli odpověď na ně) - Umístění endospory v buňce Proces vzniku endospory asymetrickým dělením buňky Endospory kromě námi izolovaného rodu Clostridium vytváří i např. Bacillus (aerobní tyčky), Desulfotomaculum (anaerobní tyčky), Sporosarcina (aerobní koky), Sporolactobacillus, Oscillospira, Thermoactinomyces. Pouzdro - kapsula - je silně hydratovanou strukturou vně buněčné stěny buňky, složenou většinou z polysacharidů a zřetelně oddělující buňku - jeho tvorba je ovlivněna složením media – velikost tedy není geneticky kódována, záleží na vnějším prostředí - v prostředí slouží jako ochranná vrstva proti vysychání a detergentů, dále např. proti bakteriofágům fágům. Slouží i k vazbě na povrch předmětů, tvorbě biofilmu - u klinicky významných druhů působí proti protilátkám a fagocytóze, proti první vlně imunitní odpovědi - skládá se z mikrokapsuly (do 0,2nm, bílkoviny, lipidy, polysacharidy; průkaz není možný mikroskopicky) a makrokapsuly (polysacharidy nebo bílkoviny, celulóza; minimálně dvakrát tlustší než buňka) Materiál a použité mikroorganismy: O/ vlastní izoláty vykultivované za cvičení Izolace bakterií z půdy (Azotobacter, Clostridium) O/ Bacillus cereus CCM 2010 O/ podložní a krycí skla, bakteriologická klička O/ střička s vodou O/ filtrační papír O/ Pasteurovy pipety O/ pinzeta O/ sterilní voda O/ Negativní barvení (pouzdra): kongo červeň, nigrosin, karbolfuchsin, 1% HCl, methylenová modř O/ Barvení endospor: malachitová zeleň, safranin Postup: Strukturální barvení se používá k identifikaci a studiu struktury bakterií. Př: barvení endospor, pouzder a bičíku (flagely). A. Barvení spor malachitovou zelení - Schaefferova-Fultonova metoda O/ Uschlý nátěr buněk na sklíčko fixujeme trojím protažením v plameni O/ Převrstvíme malachitovou zelení, překryjeme filtračním papírem O/ Zahříváme 5 minut do výstupu par, doplňujeme barvivo O/ Opláchneme vodou O/ Dobarvíme kontrastním barvivem - safraninem nebo kongo – červení (převrstvením 30s) O/ Opláchnout vodou, usušit, pozorujeme pod imerzí, Z 1000x O/ Pozorování: Spory jsou zelené, ostatní buněčný obsah červený. B. „Barvení pouzder“ – negativní barvení = zvýraznění pozadí kongo červení O/ Na sklíčko kápněte Kongo červeň a přímo v ní suspendujte kulturu A. vinelandii. O/ Suspenzi rozetřete po povrchu sklíčka a nechejte dobře zaschnout. O/ Převrstvěte na několik sekund kyselinou chlorovodíkovou, potom kyselinu slijte O/ Neoplachujeme vodou O/ Buňky dobarvíme methylenovou modří (3 minuty převrstvit) O/ zbytek osušte filtračním papírem a dosušte na vzduchu. O/ Pozorujte imerzním objektivem světle modré buňky, světlá pouzdra a modré pozadí. C. Barvení pouzder karbolfuchsinem a negativní barvení pozadí nigrosinem O/ Klička bakteriálních buněk z Ashbyho agaru se resuspenduje v kapce vody O/ Rozetře se po povrchu sklíčka a nchá se zaschnout O/ Podložní sklíčko se převrství karbolfuchsinem do výstupu par 1 min O/ Opalch vodou a negativní dobarvení nigrosinem rozetřeným do tenké vrstvy a vysušeným, aby se nezbarvily i buňky; neoplachujeme O/ Pozorujeme pod imerzí červené buňky, růžová pouzdra a šedé pozadí D. Negativní barvení buněk rodu Bacillus nebo Clostridium O/ Klička bakterií se rozetře v kapce destilované vody, přidá se kapka nigrosinu O/ Rozmíchá se kličkou a rozetře se druhým sklíčkem O/ Bez oplachování se nechá zaschnout na vzduchu Pozorování: Pozorujeme zelené spory uvnitř červených buněk a můžeme hodnotit tvar a umístění spor uvnitř těchto buněk (napomáhá identifikaci sporulujících druhů). Pouzdro: pozorujeme zvýrazněné okraje pouzdra – hromadí se u nich barvivo, které nemůže pronikat do slizovité vrstvy (negativní barvení pozadí). V případě barvení pouzder horkým karbolfuchsinem jsou pouzdra růžová a viditelná díky šedého pozadí nabarveného nigrosinem. Význam barvení spor do Závěru: Používá se na diferenciaci spor bacilů a klostridií i na rozlišení askospor kvasinek. Spory se velmi těžko barví i po fixaci, neboť mají silný, špatně prostupný obal. Chceme-li spory obarvit, musíme použít koncentrovaná barviva za tepla nebo různá mořidla. Takto obarvené spory se těžko odbarvují kyselinami a jinými sloučeninami (např. alkoholem), čehož se využívá k diferenciaci spor. Barvitelnost spor ovšem záleží na jejich vývojovém stádium, je podmíněna stářím kultury, kvalitou živné půdy, individuálními vlastnostmi mikrobů, a proto nelze barvících metod používat schematicky. Barvitelnost spor se také (podobně jako u plísní) zlepší použitím sporulačních médií (s přídavkem manganu). Význam negativního barvení pouzder do Závěru: Negativní barvení se používá k mikroskopickému stanovení pouzder a slizů a k měření velikosti bakteriálních buněk v případech, kdy by došlo fixací ke změně velikosti buněk a deformaci pouzder. Bakteriální pouzdro je větší při kultivaci např. ve 20% sacharóze. U patogenních mikrobů mají pouzdra určitý vztah k jejich virulenci. Mají-li pouzdra antigenní vlastnosti (struktury organismu cizí provokující tvorbu protilátek), mohou být podkladem typové imunospecifity. Pouzdra mohou hrát i určitou roli v metabolismu bakteriální buňky – zejména v regulaci příjmu a výdeje vody. Kmeny vytvářející pouzdro rostou na agaru zpravidla v podobě hladkých kolonií. Tyto tzv. S-formy (smooth) mohou spontánní mutací přecházet v drsné R-formy (rough) bez pouzdra. Některé složky pouzdra jsou vylučovány do prostředí v podobě slizu (M-forma, např. Leuconostoc mesenteroides). Přímé barvení pouzdra: protože jsou tvořena látkami hlenového a želatinového charakteru – převážně z polysacharidů, mukopeptidů a kyseliny hyaluronové, tak běžná barviva nepřijímají. Chceme-li je obarvit, musíme preparát nejdříve mořit (např. síranem železnatým nebo měďnatým) nebo použít k jejich průkazu metody negativního barvení – např. metody dle Burriho. Pro doplnění teorie ke cvičení ke zkoušce: Pozorování endospor: Mikroskopie: vysoce světlolomné útvary nepřijímající Gramovo barvivo Tvar, velikost a uložení – charakteristický znak pro identifikaci • Oválné - Bacillus anthracis, B. cereus, Clostridium botulinum • Kulaté – Cl. tetani, B. sphaericus • Cylindrické, elipsoidní. • terminální = na konci tyčinky (C. tetani jakoby paličky, proto byl dřívější název „Plectridium tetani“, pléctron = řec. kladivo), B. stearotermophilus • centrální (C. histolyticum, C. novyi, C. septicum, B. anthracis, B. cereus) • subterminální = paracentrálně = mezi středem a pólem buňky, většinou (C. botulinum, C. sporogenes, B. brevis) Velikost – všímáme si, zda a ve kterém místě spora vyklenuje buňku. Zda je průměr spory větší, než tloušťka vegetativní buňky Clostridium tetani Cl. botulinum B. anthracis Medicínsky významné jsou spory rodů Bacillus a Clostridium Clostridium botulinum: • Textové pole: • sporulující buňky odolávají 2-6 hodin teplotě 100 °C oproti nesporulujícím, které hynou po 30' při 70 °C! • Spory inaktivovány po 20' při 121 °C vodní páry při • 2 atm (0,2Mpa) a po 90´ - 180' při 160 - 200 °C suchého tepla, vysoce termorezistentní, přežijí až pětihodinový var Clostridium tetani – tetanus. Ke zničení spor nutno působit 100°C po 90 minut. Bacillus anthracis – biologická zbraň, anthrax Spory druhu Bacillus thuringiensis: - používají se jako biopesticidy (cíleně na housenky určitého druhu škůdce) Stabilizace makromolekul spory: - přítomnost specifických bílkovin - ztráta vody a její náhrada vápníkem. Význam a odolnost spor Pro bakterii představuje spóra možnost přečkat podmínky nevhodné pro život i po tisíce let, jsou také prostředkem šíření bakterií i na značné vzdálenosti a v různém prostředí. Tvorba spory není odpovědí na prostředí, ale přípravou na nepříznivé podmínky. Makromolekuly ve spoře jsou stabilizovány přítomností specifických bílkovin, dále ztrátou vody a její náhradou vápníkem. Jsou odolné k působení UV záření, záření γ, k vysoušení, lysozymu, teplotním změnám, nedostatku živin a působení mnoha dezinfekčních prostředků. V ethanolu mohou přežívat několik měsíců. Sporicidní látky: ethylenoxid, beta-propionlakton, koncentrované louhy a kyseliny, formaldehyd při prodloužené expozici, kyselina peroctová – Persteril, jodové preparáty, chloramin. Většinou je nalézáme ve vodě a půdě, kde mohou přežívat až po extrémně dlouhá časová období (1 milion let). Sporulací nazýváme proces vzniku (endo)spory. q Ke studiu sporulace je používáno bakteríií rodu Bacillus, hlavně B. subtillis q Během sporulace B. subtillis můžeme rozlišit 7 fází (I –VII), jež lze charakterizovat morfologicky a na molekulárně biologické úrovni. Za proces vzniku endospory zodpovídá 7 – 8 genů. q Proces začíná ve fázi G1, v průběhu vzniku přepážky (ne konci G1) je jž jasné, zda vznikne vegetativní buňka nebo spora q Sporulace může být i při max.počtu živin, ale hlavně ve stacionární fázi q Buňka přechází od binárního dělení ku sporulaci q V místě přepážky dvojité vchlípení cytoplazmatické membrány q Prospora se utváří v tzv. sporogenní zóně. Primárně se přepisují geny, které připraví prostor pro sporu, zvyšuje se kvantum volutinu (= první známka sporulace). Druhým signálem sporulace je zvýšení množství enzymů. Buňka zvyšuje spotřebu acetátu, zvýšení počtu enzymů Krebsova cyklu a hydroláz q Z biochemického pohledu se na procesu sporulace se podílí amylázy, proteázy, fosfatázy, Dnázy. q Sporulaci lze zastavit nadbytkem utilizovatelného cukru. Asporulační medium: s glukózou. Jednou odstartovaný proces sporulace již nejde zastavit. q Proces tvorby začíná replikací DNA a rozbalením bakteriálního chromozomu do dlouhého vlákna. Vchlípením CM se vytvoří septum, které rozdělí buňku na dvě nestejné části. Do obou se rozdělí DNA. Menší část - prespora – se obaluje septem – získá tak dvojitou membránu a ocitá se uvnitř buňky. Mezi memmbánami vzniká tuhý kortex z peptidoglykanu. Do prespory se vkládá mnoho vápníku a syntetizuje se v ní kyselina dipikolinová. Kalcium dipikolinát je charakteristická složka pouze v endosporách. Pod kortexem vzniká další vrstva peptidoglykanu, na povrchu celé spory pak proteinový obal bohatý na cystein. Světlolomnost (fázový a Nomarského kontrast). Mateřská buňka se rozpadá, uvolnění spory. Fáze O o Mateřská vegetativní buňka (sporangium) přechází z binárního k asymetrickému dělení. Fáze I o Tvorba axiálních filament k rozdělení bakteriálního chromozomu. Fáze II o Je ukončena replikace buněčného genetického materiálu, a ten se následně rozestupuje k pólům buňky. Končí invaginace cytoplazmatické membrány. Přestává fungovat DNA spory, Kroky přebírá druhý nukleoid. Sporogenní zóna je homogenizovaná a zahuštěná. Má vždy jinou hustotu než zbylý obsah buňky. Fáze III o SporeDev.JPGCharakterizuje ji proliferace cytoplazmatické membrány kolem obou vydělených částí buňky, u spory dochází k zaobalení dvěma membránami – intina a extina (vchlípením cytoplazmatické), vzniká prospora. o Volutinu ubývá o Hustotou se blíží hustotě spory o Není dosud světlolomná (refraktilní), nezobrazí se tedy, nesvítí, při mikroskopii ve fázovém kontrastu. Fáze IV o Tvoří se kortex spóry (tvoří jej aktivní chromozom) s peptidoglykanem o složení líšícím se od peptidoglykanu buněčné stěny (viz dále). V momentě vzniku kortezu již dovnitř nepronikne nic než voda. Při vzniku kortexu již minimální obsah volutinu. o Ve spóře obsažena kyselina dipikolinová (syntetizována mateřskou buňkou, transport; malá molekula; množství regulováno – míra termorezistence. Kyselina stabilizuje kvarterní strukturu DNA ve vazbách) a velké množství Ca^++ iontů (pro ně není primární transportní systém, transport antiportem). o Endospora je již světlolomná, se vznikem kortexu již spora nepropustná pro barvivo, obarvitelná až při výstupu par. Fáze V o Probíhá syntéza pláště – 2 vrstevného, poté dalšího pláště. o V době vzniku pláště již spora obsahuje minimum vody o U příslušníků rodu Bacillus vzniká exosporium složené z deseti proteinů, polysacharidů a lipidů. o Unikátnost bílkovin pláště: chemotaxonomii Fáze VI o Maturace endospory a lýza mateřské buňky, uvolnění zralých spór Fáze VII o Volná zralá spóra. Vnější architektura, počet a tvar plášťů závisí na buňce. Seznam proteinů zahrnutých do procesu sporulace lze nalézt na adrese http://expasy.org/cgi-bin/get-entries?KW=Sporulation. Jedinečné a charakteristické struktury spory: Kalcium dipikolinát Proteiny stabilizující DNA Kortex DNA reparační enzymy v procesu germinace Germinace Germinací rozumíme rychlý proces klíčení spory. Začíná spontánní aktivací spory. Klíčení spory B. cereus Aktivace – destabilizací pláště – při působení teploty 70-85 °C po 5 – 10 minutách, dalšími aktivátory jsou malé organické molekuly – malé kyseliny, vitaminy, zvýšení počtu bazí, L-Ala, Ado a Ino. V laboratořích zahřátí v přítomnosti vody. Aktivovaná spora přijímá vodu a ztrácí rezistenci – bílkovinné stabilizátory jako vnitřní součásti se začínají rozkládat, vzniklé aminokyseliny slouží jako stavební kameny nových proteinů. – Nejprve ovlivněna proteosyntéza (hlavně degradační enzymy – proto ve spoře dostatek Mg) – V době, kdy buňka tvoří energii začíná fungovat regulační aparát chromozomu (ATP= signál aktivace chromozomu) – První enzymy – glykosidázy – metabolizování kortexu, poté extiny (fosfolipidy+bílkovina+polysacharid) Lytický enzym: p68 => p29 (kortikohydroláza) – depolymerizuje kortex pro nástupný průnik vody. Po dvou hodinách po germinaci spory následuje dělení vegetativní buňky. Inhibice klíčení: D-Ala, MgCl[2], PMSF 1) terminální germinace – na kratším konci spory 2)centrální – v podélné ose spory Stavba zralé spóry · Endospore.gifJádro – obsahující sporoplast či protoplast : stroma spóry představuje gelovou matrix, tvořenou bakteriálním jaderným ekvivalentem – nukleoidem, kalcium dipikolinátem (CDPA) nebo pyridin-2,6-dikarboxylovou kyselinou, jež nahrazuje vodu při udržování kvarterní struktury při vazbách, polyaminy, aminokyseliny a 3-fosfoglycerát; refrakční index činí 1,54. · Kortex Rozlišujeme vnitřní kortex (20% kortexu) či stěnu spóry a zevní kortex (80 % kortexu). Zajišťuje nepropustnost ( nebarvitelný!), struktury s nízkým obsahem vody jsou barvitelné dle Wirtze. Refrakční index kortexu činí 1,47. Kortex je tvořen peptidoglykany, leč jen 20-30 % peptidoglykanových jednotek je shodných s jednotkami v buněčné stěně. Zbylých 50-60 % jednotek představuje N-acetylmuramovou kyselinu modifikovanou na N-acetylmuramyl –laktam, dalších 18-20 % kyseliny N-acetylmuramové je spojeno s L-alaninem namísto tetrapeptidu . Tyto modifikace zajišťují enzymy: membránově vázaná Glu-mesoDmp hydroláza a cytosolová Ac-Ala-Glu-mesoDmp lyáza. · Perikortikální membrána · Pláště složené z proteinů bohatých na cystein (a podobných keratinu), zajišťují odolnost spór k působení chemikálií. · výše zmíněné exosporium u rodu Bacillus Mikroskopie některých sporulujících druhů bakterií: Bacillus cereus Clostridium tetani – paličky Clostridium botulinum TEM, spora Bacillus stearothermophilus Paenibacillus polymyxa – oválné, vyklenující spory v ))))))) Sporosarcina ureae – kulaté spory uvnitř čtveřice (balíčku) buněk