Kristina Štěpanovská Obecná mikrobiologie-cvičení BIMG (2. ročník, 4. semestr) 16.4.2008, st 13:00-14:50, sk 03 Protokol č. 8: Stanovení citlivosti k antibiotikům, stanovení koncentrace antibiotik Úvod: Antibiotika jsou chemické látky produkované různými mikroorganismy nebo synteticky vyráběné. Navzájem se liší chemickou strukturou, spektrem účinnosti a mechanismem účinku. Spolu s desinfekčními prostředky se antibiotika řadí mezi chemické kontroly mikrobiálního růstu, jsou produkována proto, aby potlačila růst konkurenčních druhů a získala tak výhodu pro druh, který je produkuje. V přirozeném prostředí jsou největšími producenty antibiotik houby, které exkrecí svých sekundárních metabolitů ovlivňují mikroorganismy ve svém bezprostředním okolí (např. rody Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium, aj.). Vzhledem k této schopnosti ovlivňovat růst mikrobů je část těchto produktů využívána jako chemoterapeutické látky. Pro zhodnocení účinku je důležitá koncentrace látky, doba kontaktu a je-li pro bakterie letální (baktericidní) nebo způsobuje-li přechodnou inhibici růstu (bakteriostatické látky). Je také důležité určit citlivost mikroorganismu k aplikované látce (z důvodu aplikace v medicíně), což se provádí nejčastěji pomocí difúzního testu v agarovém mediu nebo pomocí dalších metod. Materiál: ◦ Petriho miska s Mueller-Hiltonovým agarem ◦ sterilní Petriho misky s MPA (M 2) ◦ sterilní vatová tyčinka ◦ standardy a vzorky oxacilinu ◦ kokrovrty a skalpely ◦ pipety, zkumavky ◦ antimikrobiální disky ◦ sterilní pinzeta ◦ pravítko ◦ kahan Bakteriální kmeny: ◦ Staphyloccocus aureus NCTC 8511 ◦ Morganella morganii subsp. morganii CCM 680 Postup: úkol č. 1: Stanovení citlivosti bakterií k různým antibiotikům diskovou metodou ◦ Na připravenou Petriho misku s Mueller-Hiltonovým agarem jsme sterilní vatovou tyčinkou nanesli bakteriální kulturu ze zkumavky s šikmým agarem (Morganella morganii subsp. morganii) a pečlivě kulturu rozetřeli po celé Petriho misce. ◦ Na naočkovanou Petriho misku jsme pak pinzetou sterilně rozložili 6 testovacích disků s antibiotiky, po každém nanesení jsme pinzetu žíhali v plamenu. ◦ Nechali jsme inkubovat při 37 °C 23 hodin. úkol č. 2: Stanovení koncentrace oxacilinu v neznámém vzorku difúzní jamkovou metodou ◦ Z Petriho misek naočkovaných druhem Staphyloccocus aureus a s různou koncentrací oxacilinu jsme odečítali výsledky po 24hodinové inkubaci. ◦ Nejprve jsme počítali průměry inhibičních zón u misek se známou koncentrací oxacilinu, poté jsme počítali inhibiční zóny z misky o neznámé koncentraci oxacilinu. Vyhodnocení: Úkol č. 1: Tab. 1: Průměry inhibičních zón vytvořených kolem disků různých druhů antibiotik rozložených na MH mediu s Morganella morganii subsp. morganii c Název antibiotika (µg/ml, r inhibičních (zkratka) m.j.) zón (mm) penicilin (PEN) 10 0 cefalotin (CLT) 30 0 ampicilin (AMP) 10 13 erytromycin (ERY) 15 0 oxacilin (OXA) 1 0 chloramfenikol (CMP) 30 23,5 Úkol č. 2: Tab. 1: Závislost průměrných hodnot průměru inhibičních zón na koncentraci standardní řady roztoků oxacilinu pipetovaných na MPA s druhem Staphyloccocus aureus c standard r inhibičních zón (µg/ml) (mm) 7,81 19,53 15,625 21,5 31,25 25,75 62,5 28,375 125 29,2 250 31,5 Tab. 2: Závislost průměrných hodnot průměru inhibičních zón na logaritmu koncentrace standardní řady roztoků oxacilinu pipetovaných na MPA s druhem Staphyloccocus aureus log c standard (µg/ml) r inhibičních zón (mm) 0,893 19,53 1,194 21,5 1,495 25,75 1,796 28,375 2,097 29,2 2,398 31,5 Rovnice regrese: y = 8,1229x + 12,61 neznámý vzorek č. 4: r[1] = 21,5 r[2] = 23 r[3] = 21.5 r[4] = 21,5 r [(průměr)] = 21,875 21,875 = 8,1229x + 12,61 x = 1,141 => log c = 1,141 µg/ml c = 10^1,414 c = 13,836 µg/ml Závěr: Při stanovování citlivosti bakterií k různým antibiotikům diskovou metodou jsme zjistili, že druh Morganella morganii subsp. morganii je citlivý pouze na 2 druhy použitých antibiotik z 6 použitých. Na antibiotika penicilin, cefalotin, erytromycin a oxacilin tedy citlivý není, protože kolem disků s těmito druhy se nevytvořila žádná kruhová inhibiční zóna. Kolem disku s ampicilinem se vytvořila inhibiční zóna s průměrem 13 mm, což znamená, že Morganella je na toto antibiotikum velmi citlivá (5 – 10 mm = citlivý mikroorganismus, nad 12 mm velmi citlivý). Kolem disku s chloramfenikolem se vytvořila zóna s průměrem 23,5 mm, což znamená, že je na toto antibiotikum také velmi citlivá. Velikost zóny je ovlivněna schopností antibiotika difundovat mediem, používají se proto pouze ty antibiotika, které difundují dobře, a jako medium se ke kultivaci používá Mueller-Hiltonův agar, ve kterém látky volně difundují. Při stanovování koncentrace oxacilinu v neznámém vzorku difúzní jamkovou metodou jsme nejprve spočítali průměry inhibičních zón u vzorků, kde jsme znali koncentraci oxacilinu, abychom mohli sestavit kalibrační přímku a z ní zjistit rovnici regrese. Na misce s neznámou koncentraci oxacilinu jsme pak spočítali průměr inhibiční zóny (průměrná hodnota ze 4) a dosadili do rovnice regrese z grafu. Koncentrace vzorku č. 4 byla tedy 13,836 µg/ml. Všechny misky, na kterých jsme počítali průměry inhibičních zón už jsme měli připravené, byl použit druh Staphyloccocus aureus. Principem jamkové metody je, že testované látky (oxacilin) se pipetují do jamek vyhloubených korkovrtem přímo do agarové vrstvy.