c
v
ŕ*
Úvod do studia biologi kmenových buněk
Wtt
***
Rawlins 2006
J / T» bkioK «tum ari ifch»
*
5iiMá7»]iMliHNiirJiNWJ»llli
iiMáV»]iir4^VJiif»TJI
'
Embryonální zárodečné buňky (Embryonic germ cells - EG) mbryonální nádorové buňky (Embryonal carcinoma cells - EC)
lacní
ES buněk odvozených z vnitřní buněčné mas
Verifikace kmenovvch buněk
sebeobnova x schopnost diferenciace
Embryonální kmenové buňky
mfm           V**
■
lecifické znaky/markery a vlastnost, diferenciace in vitro            Kľ
- diferenciace in vivo - chiméry
- teratomy

*
EmtayoJdH l^ka
^^    J
Embryoidní tělíska (Embryoid bodi -EB)
^jednoduché, více buněčných typů
+ tolerující genotyp
• špatně definované podmín

b)  Vmonovrstve
+ lépe definovné podmínky - malá výtěžnost
'
i
-


-■'* -    "**** A
Z£

*'
-

Leukémie inhibujicí faktor - LIF
y"^
b^m-1 _.    *Ar
blokuje spontánní i indukovanou difere
t£äj^
ryonálních plurÍDotentních
buněk
významný regulátor hemopoezy, NEUROGENEZE, kardiogeneze ... člen IL-6 rodiny (IL-6, IL-11, LIF, oncostatín M/OSM, ciliary neurotrophic factor/CNTF, cardiotrophin-l/CT-1, cardiotrophin-like cytokine/CLC pleiotropní působení

j'--
>Cŕ*&£    ^
■ y
--
Wk
,/>^
*
Z£

*
WM
IL-6     - interleukin-
IL-11   — interleukin-11
LIF      - leukemia inhibitory fa<
CT-1   - cardiotrophin-1
CNTF - ciliary neurotrophic factor
OSM   - oncostatin M
cardiotrophin-like cytokine
a£   fi
Nési
CNTF-l


LIF-R
eceptory
Po navázání ligandu na specifický receptor se tento komplex váže s vvsokou afinitou na receptor qd130 a SDOuští transdukci sianálu
IL-6
IL-11
-^

p130
p130 samotný ma k hgandum velice ni
ifinitu, tím je zabráněno aktivaci gp130 samotným ligandem!
Komplex ligand / vysoce afinitní receptor / gp130 spouští několik paralelních drah transdukce signálu, hlavní / fyziologicky nejvýznamnější se zdá dráha JAK -> STAŤ"
*
/
/
qwfl expression
^


Heinrich 2003
/
££
STAŤ - transduktor signálu a aktivátor transkripce ^signal transducer and activator of transcription)
Výber nejvýznamejsich oblasti vyžadujících metabolizmus retinolu/vit.A
A) fotorecepce
B) růst a vývoj organismu
VISION
<fih
VISION
">
SKIN
EPITHFL I Al
™E2EL i.tii.!iiŕP/
'fiA DIFFERENTIATION
IMMUNE
FUNCTION
THYMUS
L>MKHOl& ORGANS
nEF: = IOĽUľ'IQN
SPERMATOGENESIS
BEPffJDUCTIPN
EMGFIVDMAL
DEVELOPMENT
>^.
w
'
y
/
O CC
Ross, 2000
■
/
w..
ES / EC + EB + RA
■  buňky neurální
■ bunky kosterní svaloviny a adi
■ bunky srdeční a hladké svaloviny
ES / EC + monovrstva + RA
■  bunky primitivního entodermu
■ neurální buňky (motoneurony?)
RARort        EEIVPS74PP      PPPLPR
RKRRP       RP
RKRRPS362KP
AF-1 (A/B doména) - oblast regulující aktivaci transcripce, nezávisle na ligandu
DBD (C doména) - DNA vázající doména (DNA-binding domain)
LBD/AF-2 (D/E doména) - oblast regulující aktivaci transkripce, závislé na ligandu
JNK1 + JNK2
Exprese a aktivita myšího embrya (16 dpc
C
A) In situ hybridizace mRNA RALDH-2
B + C) RARE aktivita (RARE-LacZ reporter)

*Cŕ>
J-*
Schematický princip imunodete
jfm
Účinek séra na RA indukovanou neurální diferenciaci
es                                                                          «a
SF / SF S4flAÍ S SF+flA í SF
semm-free	serum-free     ^	
semni +RA	serum	
s e rum-free + RA	serum-free     ^_	
r/j
Crt
0".'
-j-
Oj
O'.'
<
Ll_
LU
Days of differentiation
MSĽTfl-t
GAJX^f
a^fet&prvteffi
0246246246
i

HFfíT
SF í SF • S4«A t S ■
>                    >
;........................fP'-
semrn-free     : mum-ftiM
s ě turn + RA
S+fiAf SF-
senmn +RA
SMjrri-ftíŕ
ISF-iflA f S: SF+fiA/SF-
s e tu m-free +R.;
. setwi-f ree + RA: serum-ŕree
i
íl    n    B   I co    to     —    zi    g
U-
CO
i'.O
CO
UL Vi
Ll_
■■.'J
H-CAM
Cytokeratin
Endo-A
6 days

■#.
N
iHi rvTíTvTTiTTvJ^f;
liniově specifických genů
neuroektoderm entoderm
_
•   -'V
•
♦  buněčná jádra
♦ cytokeratin EndoA pozitivní buňky - entoderm
♦  N-CAM pozitivní buňky - neurony
y_
íferencovane bunky
Diferen


£>
jř
č.~
^
P19:
ŽK
^
«   »
«c
**■
rx&:
** -                  «
■   v*
■    ■  *


'
■^ í
vra

r
SE

t.

/
>
inhibujici fa
posiluje RA indukovanou neurální diferencia
C buněk linie P19
+**>-
Difieren
SF      SF/LIF    SFÍRA SF/LIF/RA
H-CAM
Neuron-specific II b-tubulin
GAP-43
*
m
LIF    -     -      -     +    +     -     -      +    + RA.....+++    +
hours   0   24   48   24   48   24   48   24   48
Masň-f	mim   • a  m^
	
Pax-6	»■■          "*
	
a-ŕétopm&eäi	— —
	
GATA^f	I            w%9*
	
HPfíT	
H	Prohferace ^		
			
		^SF — SF/LIF	
ä     1000    -		— SF/RA	
5		-x-SF/LIF/RA	
O         800    -		^^^^^^                                                                    /	
Q O) 3		//I	
^       600    ■		/   /       í	
O		/ /	
S		/ /	
Q.        100    -			
je o		^S?/ ;   .A	
■"        200    -		^^^^      v s	
		^^*ss^-»----*	

f
4f;h Time
t&
&
neuroektoderm entoderm
^
J*&
Apoptóza

LIF RA hours	+    +     -     -      +    + .....+    +     +    + 0    24    48   24    48   24   48    24   48	
Lamin B		66kDa 45kDa
	__                        —	
DNA
G row U i Factor Receptors
Lxtnuvllulai
U0 126
^«
L
^^^h
Cytokine Receptors
AG490
N on-Acceptor Tyrosine Kinases
SB-202190
exprese a postranslacni modifikace regulačních proteinů
8ri.K»(:ycEfnm.
c-Myc.'p2]WAI
Bowman 2000
iiitlL'i irili.41 li u\. Prnliferation,    ^1 Survival. Oncogenesis
Z£
transkripční aktivita Stat-3 (reporter pAPRE-luc) transkripční aktivita AP-1 (reporter p3TP-Lux) transkripční aktivita RAR/RXR (reporter pRARE(32-luc)
Detekce stupne diferen

EC buněk indukovaných neuralmm směrem
'specifické protilátky)

*
".w
t£