Ekotoxikologické biotestv rozdělení, přehled, použití Doc. Ing. Blahoslav Maršálek, CSc, Oddělení experimentální fykologie a ekotoxikologie, Botanický ústav AVČR, Květná 8, 603 65 Brno, , Tel/Fax 05 43241911 a RECETOX - Výzkumné centrum pro chemii životního prostředí a ekotoxikologii, Masarykova univerzita Kamenice 3, 618 00 Brno, Definice biotestu • Biotest lze definovat jako proces, při němž je testovací systém (tkáně, organismus, populace apod.) exponován v přesně definovaných podmínkách různými koncentracemi zkoumané chemické látky nebo směsného či přírodního vzorku. Rozdělení ekotoxikologických biotestu (základní přehled těch nejčastějších) • Dle doby expozice dělíme ekotoxikologicke biotesty na • akutní • semiakutní (semichronické) • chronické Dle testovacího uspořádání" • Statické • Semi-statické • Průtočné Dle pokročilosti designu testovacího systému (Také 4 generace biotestu) • 1. generace -klasické (standardní) • 2. generace -mikrobiotesty • 3. generace -biosenzory, biosondy a biomarkry • 4. generace - on-line systémy s dálkovým přenosem dat Dle trofické úrovně testovacích organismů • producenti, • konzumenti, • destruenti Dle testované • voda, • půda, • vzduch, • sediment, • odpad, • chemická látka matrice Dle spektra testovacích organismů • Jednodruhové (Single Species), • Vícedruhové (Multi Species s přírodními populacemi i laboratorní směsi kultur)_ Dle typu testovaného vzorku • čisté chemické látky (hydrofilní, hydrofobní, těkavé), • směs látek (známých i neznámých), • přírodní vzorky (většinou neznámé, směsné, s neznámými interakcemi - nejsložitější interpretace Dle způsobu přípravy vzorku • definované koncentrace chemických látek, • testování výluhů přírodních vzorků (extrakce org. rozpouštědly, DMSO, vodou, různé pH, teplota atd.), • semipermeabilní membrány, • přímé testy (Direct Tests, Solid Phase Tests, Whole Effluent etc.) • TIE(C-18,AC, pH....) Dle stupně komplexnosti detekčního systému (Od nejjednodušších k nejsložitějším ) enzymy, biosondy, buněčné a tkáňové kultury in vitro, intaktní živý organismus, populace, micro/mezo kosmos, terénní experimenty Dle způsobu vyhodnocování • letální efekty (mortalita, imobilizace), • subletální efekty (chování organismů - např. rychlost a směr pohybu), hodnocení fyziologické aktivity (fotosynteticke asimilace, enzymatická aktivita, efekty na membránách, přírůstky - délka kořene, počet buněk v populaci, nebo hmotnost organismu, náchylnost k napadení chorobami, škůdci či parazity apod)., reprodukční aktivita, • malformace a teratogenita atd. Specielní testy pro hodnocení rizik v životním prostředí • trofie, • mutagenita/genotoxicita nejen na bakteriích, ale také na rostlinnách, volně žijících zvířatech a rybách, • teratogenita, například na obojživelnících -Xenopus laevis, • embryotoxicita a reprodukční testy na rybách, korýších, obojživelnících, ptácích, hraboších apod. • Detekce spec. mechanismů (endokrinní disruptory, TCDD apod.) Biotesty procesů • Biokoncentrace • biokumulace • testy pro hodnocení biodegradabihty Ekotoxikologické biotesty Stanovení ekotoxicitv - souhrn 1) Standardní biotesty 2) Alternativní biotesty 3) Další biotesty (specifické mechanismy, in vitro testy) 4) Testy procesů (biodegradabilita, bioakumulace...) 5) Testy orgánové toxicity s laboratorními zvířaty - obratlovci, savci "humánnítoxikologie" 6) Experimentální mikro a mezokosmy 7) Polní studie > > J > Laboratorní ekotoxikologické biotesty In situ hodnocení efektů STANDARDNÍ (standardizované) EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY ■ Standardizace - maximální standardizace kroků experimentálního postupu s cílem omezit faktory "intra-laboratorní" variability ■ Výhody standardních biotestů - zaručení jednotnosti a opakovatelnosti výsledků - při dodržení postupu - srovnatelnost výsledků z různých laboratoří - validovane výsledky (viz dále) jsou vhodné pro ROZHODOVÁNÍ (sanace, pokuty...) - malá nutnost optimalizace ... ■ Nevýhody standardních biotestů - velmi specifická a omezená vypovídací hodnota ("akutní leta I i ta pro korýše Daphnia"), zpravidla vhodné jen pro zařazení (klasifikace) toxicity látek (více - středně - méně toxické ...) - omezený počet standardizovaných postupů, zpravidla jednoduché (akutní) efekty EKOTOXIKOLOGICKE BIOTESTY Každý biotest Uednodruhové, vícedruhové, mikrokosmy...) je pouze zjednodušením = modelem ekosystému • cílem ekotoxikologických studií je pochopení, charakterizace a ev. předpověď účinků v celých populacích, společenstvech, ekosystémech • z experimentálních výsledků je nutno provádět EXTRAPOLACE • ? jsou laboratorní druhy relevantní pro přírodní organismy • ? je laboratorní expozice (voda) relevantní pro přírodní podmínky (sediment) • ? jsou výsledky na jednom druhu relevantní pro populaci, společenstvo • ? jsou výsledky in vitro testu (stanovení dioxinové toxicity) relevantní pro efekt na celém organismu • pro vyjádření nejistot plynoucích z extrapolací jsou často používány tzv. extrapolační faktory nebo faktory nejistoty - (UF- uncertainity factors, UF = 1, 5, 10 -1000) - aplikace = násobení (dělení) získaných výsledků Interpretační potenciál ekotoxikologickych biotestu • Dobře definují toxicky potenciál čistých látek • Biotesty počátečního skríningu (tzv. toxicity presence/absence tests). • Propojení s chemickými analýzami, aby determinovaly a prioritizovaly vysoké hladiny, nebo biodostupnost kontaminant v přírodě. • Upozorní na interakce mezi přítomnými polutanty, které z chemických rozborů nevyplývají. • Pozor na přímé interpratace lab. testů pro přírodní podmínky!!!! EKOTOXIKOLOGICKE BIOTESTY Experimentální design které parametry charakterizují biotest, které je nutno evidovat 9 ■ Zdroje variability Komplexnost biologického systému Doba expozice Uspořádání expozice Expoziční scénář Biologický systém - organismus, druh Další specifika biologického systému Hodnocený parametr, endpoint Další abiotické faktory v experimentu In situ & In vitro • in situ (terénní) + dlouhodobá expozice integrace toxických vlivů • - mnoho neznámých faktorů, problematická interpretace dat • in vitro (laboratorní) + faktory pod kontrolou, standardizované, srovnatelné, jsou v legislativě • - některé biotesty jsou vzdáleny přírodě - pozor při interpretaci! Současné trendy v ekotoxikologickych biotestech • Miniaturizace • zkrácení doby inkubace při zachování citlivosti testu • zjednodušení a možnost alternací při vyhodnocování testu (fluorescenční metody, molekulární sondy, průtoková cytometrie atd.) • bezpodmínečná nutnost zapojení biotestů reprezentujících různé trofické úrovně v ekosystému - kombinace- viz text! • využití nových vědeckých poznatků (nové Drafty norem) • Co nejvíce se přibližovat při testování reálné situaci v terénu • Stále častěji také sada biotestů zaměřených na mutagenitu, genotoxicitu, teratogenitu a biochemické márkry, enzymatické aktivity, či buněčné kultury, zaměřené na konkrétní typ látky, nebo účinku. • Dálkový přenos dat z on-line systémů Mikrobiotesty II. generace Mezi biotesty II generace, tzv. mikrobiotesty patří ty které: • využívají klidová, stadia testovacích organismů -nevyžadují udržování a kultivaci matečných kultur (MetPad, SOS chromotest, Chromotoxkit, Sediment Chromotest, Microtox Thamnotoxkit, Rotoxkit, Daphtoxkit, Ceriotoxkit, Protoxkit, Algatoxkit.......) • nahrazují používání zvířat pro testy toxicity (in vitro tkáně ryb, baterie Thamno-Roto-Chromo, ■ ■ ■ ■ Ě • šetří laboratorní a kultivační prostor, vyžadují jen malé objemy vzorků, lze najednou zpracovat Mikrobiotesty II. generace Možnosti využití mikrobiotestů • čistírny odpadních vod (odpadní vody, čistírenské kaly, ověření účinnosti čistírenského procesu) • testování reziduí pesticidů a kontaminace zemědělských půd • monitoring úniků cizorodých látek ze skládek různých typů odpadů • sledování dopadů a rozšíření ekologických havárií, monitoring procesu dekontaminace po havárii • monitoring kontaminace podzemních vod • sledování biodegradability látek v modelových a přírodních podmínkách • rychlé screeningové testování nových látek a chemikálií • nasazení všude tam, kde se používají standardní ekotoxikologické biotesty, ale je zapotřebí zpracovat I ' I o / ■ ■ J_ ■ 'I v"v'\ Srovnáni citlivosti standardních organismů používaných pro EB (dvojchroman draselný - mg/l) Poecilia reticulata 180(120-240) Lemna minor 30(10-60) Sinapis alba 25(10-40) Microtox 3,8(2,1-5,5) Daphnia magna 1,4(0,8-1,8) Pseudokirchneriella subcapitata 0,5 (0,24-0,78) Thamnocephalus platyurus 0,1 (0,08-0,25) Citlivost k toxikantům je „species- dependent" i PA'PHNIA MAGNA" 24hr tlv STREPTOXKíT F/ 24 hr f*) -■ THAMNQTOXKIT F ROTOXKiTF "24 hí ' ' MJ'CROTOJÍ '■■';■ 20'- ■■.■ SOa2'MjSOj) 5600 5SO0 3900- 3700 17000 [S')L i M OTHER INORGANIC COMPOUNDS mg/5 NaNO, 4.12 6.49 Free NH3 190 L 13 4.6 L 2 (5)L NH4C! 320 120 (pH 7.81 / 160 2. ORGANIC COMPOUNDS-.-: " ■lM HALOGEN ATI' 3'ALK AWES ma.f! ■ ' '" Carrion tetrachloride 37 33.7 [l&'l1- Chloroform 73 L > 1000 :.oL 670L Dichlorome thane 900 > 1000 2800 <&'IL 1,1,1-Trichlofoethirte 1 1.2 <4Shr) í 910 > 100 8.04 {ie-)L :2.Z ÄĽCOHOIS mgfl ■:: ■ .-..■, - ■ ...::^§M Ethanol 19000/28000 39000 30000 / 39000 35000 Ethylene glycol 60000 39000 130000 621 1 i________________i IbUpHJ^dJHJt 2 9000 á->nr\ jK'iL ! Proto jsou nutné baterie testů DASHNIAMAGNA :24hr. ■ . ■. ÔTREPTOXKIT f 24.;hr (*) . i-THAMNOTOXKIT p;f 24:hr (« *) ROTOXKIT- F:: 24.hr ' ' ": ■ M1CR0TOX ..30V- Methanol 33000 39000 36000 320000 | 2.3 CARBOXYL1C AGIOS !mg,U ^l^ ' :::■■.:■.■ Trichloroacetic acid 1,46 20.6 Sodiu.n oxalate 410 210 64.2 _ ..j------------------------------------------- 2,4-Jicnloro-phenoxy-acetic acid 190 150 117 Acetvlsaiicylic acid 180 130 140 :.■;;■,;;■: .,,■■■:■ ;:..■■■:■ - ■■ '■ ■' -::. "V. ■- :- "t Aniline 0.9 L 3.12 0.85 «2 (1ViL 3,4-Dichloroanitine 0.2 L - 6 L 0.11 62 L ::2^:p»möLs-ittm^ : Phenol 7.8 ! 21 L 10.9 33 1200 3SL 2.6 DETERGENTS (mg/ll ■:. ' ■ :^. : :■ . Sodium Dodeeyl Sulfate ISLSI 17.4 L 29.1 10.6 1.4 L 1.1«. 2:7 AROMATIG^HYDROCARBGNS tngfl)' Benzene 510 >100 ■ >50 >1000L 1O0L / P) = Presently replaced by the THAMNOTOXKIT F r*) = Has replaced the STREPTOXKTT F (L) = Value based on literature study Složené z různých organismů!!! ■ DAPHN1Ä;K1ÄGNÁ::' 24 hr ;STREPTOXKITF " -24hr. i*) THAMNOTOXK1T F .-24.hr í* *> ifiCH.OXKIT F- : 24 bi M1CROTOX :30'. Mn2 + (MnSOvH,0) 10 81.S 23.3 34.6 13.7 <15')L Na + (NaCI) 400/2200 2700 1800 1500 20000(5')L Ni2"*" {Ni(Acetl2) |NÍCI2'2H20) (NiS04-6H20) 21L 4L 10.9 4.23 20L 5.55 3.79 2.21 5.83 Pb2 + IPbCI2) (Pb(N03)2) 0.33§u 1.63 9.96 0.41- Sb3 + fSbCM 2.99 5.27 11.2L Tl+ 0.96 bentazon 13.2 /10.1-16.6/0.98 .14.0 /l 1.3-16.7/0.98 *imidazolin 94.7 /90.5-98.9/0.98 10.1 / 7.4-12.8/0.96 96.2 /93.1-99.3/0.94 *gluphosi- 9.6 / 8.5-10.7/0.98 te ammonium Fig.3: Sensilivity evaluation of the microbiotesits versus conventional tests applied on the toxic sediments, waste waters and deep well % samples 50 n Sensitivity ranking D Microbiotests more sensitive than conventional tests Microbiotests equally sensitive as conventional tests Microbiotests less sensitive ilinn conventional tests Fig.2: Acute toxicity detection potential of the individual bioassays for a deep well sample toxic units 4,0 ABC DE F G A Thamnotoxkit E Microtox B Rotoxkit F Daphnia magna C Ceriodaphtoxkit G Raphidocelis subcapitata D Protoxkit H Poecilia reticulata Ekotoxikologické biotesty - ceník FIRMA CENA (Kč) perloočky ryby řasy hořčice Mikrotox Ekos Hradec Králové 3 150 2 280 2 970 2 100 1950 Ekotest Hradec Králové 3 000 3 812 3 896 1870 m KHS České Budějovice w 3 500 ■ 3 500 m KHS Brno 4 000 4 000 4 000 4 000 - KHS Ostrava 1840 3 770 2 310 1 130 2 240 VURHVodňany 4 000 16-18000 12 - 13 000 kapr, pstruh 6 - 8 000 2 - 3000 o 47 laboratoří EC-ECU(Kč) 24h 200-1 700 (6-69 000) 96h 300-1 500 (9 - 45 000) 72h 300-1 500 (9=45 000) TEST CENA (Kč) Toxi-Chromopad-sedúnent 518(3 opakování) Toxi Chromotest 512 (6 opakování) Thamnotoxkit 915 (5 ředění, 3 opakování) Rotoxkit 915 <5 ředění, 6 opakování) Používané & použitelné • Přehled uvedený v textu = 1. Generace EB • Národní legislativy mají již i normy na 2. generaci (mikrobiotesty) - ČR také!!! • Úpravy a modifikace musí být popsány a zdůvodněny • Pro speciální případové studie lze využít speciální (opakovatelné a validované) testy Agentury a ekotoxikologicke biotestv • agentury, které vydávají a aktualizují normy a metodiky také v oblasti ekotoxikologických biotestů. • VUSAjetoU.S. EPA, aASTM, • v Kanadě je to například Environment Canada, • ve Francii AFNOR, • v Německu DIN Situace v ČR • ČSN • ČSN-EN-ISO. • Aby to nebylo jednoduché, jsou současně platné například také tzv. oborové normy pro jednotlivé resorty, či odvětví. Příkladem mohou být Oborové normy pro vodní hospodářství, které mají označení TNV. Závěr • Schopnost sestavit takovou baterii ekotoxikologických biotestů, která bude mít co nejreálnější vypovídací hodnotu a jejíž interpretace bude přesně odpovídat na problematiku studované lokality patří k důležitým znalostem každého ekotoxikologa. K tomu je samozřejmě důležité mít přehled o možnostech nejen v normovaných testů, ale také jejich alternativ a nových publikací oboru.