Ekotoxikologicke biotesty s producenty (Uvod do bloku přednášek) B. Maršálek Terminologická poznámka: • Ekotoxikologické biotesty využívající producenty (fotoautotrofní organismy) lze označit také jako testy fytotoxicity. • fytotoxiny jsou toxiny produkované rostlinami (alkaloidy, glykosidy, antibiotika atd.). Tato terminologie j e mezinárodně ustálená, takže stejně jsou chápány mykotoxiny (toxiny produkované plísněmi a houbami), cyanotoxiny (toxiny produkované sinicemi) a pod. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty D • Sinice (fotosyntetizující gramnegativní eubakterie) koloniální (Microcystis), vláknité (Anabaena, Nostoc) a pikocyanobakteria jednobuněčné (Synechocystis). Dusík fixující sinice jsou velmi citlivé na toxické látky a inhibice nitrogenázy patří mezi vhodné endpointy. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty • Rasy - jednobuněčné, cenobiální, vláknité, sladkovodní, mořské • Rasové testy trofie a toxicity • Kromě klasických biotestů s j ednou řasou, j sou používány tzv. Multispecies algal asays (paralelní kultivace zástupců zelených řas, sinic a rozsivek dle podmínek zkoumané lokality • fyziologické testy (hodnocení fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity, • Kompetice a reprodukce přírodních populací fytoplanktonu a fytobentosu. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty D • Mechy a lišejníky - • bioindikační postupy s přirozenými společenstvy lišejníků, nebo s tzv. transplantovanými druhy, u kterých známe stáří a historii. • V případě mechů nejsou propracovány metodiky ekotoxikologického hodnocení tak podrobně jako v případě lišejníků, ale např. vodní mech Fontinalis je využíván j ako producent s vysokým potenciálem pro bioakumulaci kovů. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty D • Okřehek a submerzní vegetace- • OECD 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test (Draft New Guideline, ). V některých laboratořích j e také používána Spiroděla polyrhyza, ale dle našich zkušeností je Lemna minor citlivější, než Spir oděla. Dále je využívána Elodea canadensis a Myriophyllum sp. Jejich nevýhodou je sezónnost použití, která je omezena na květen až říjen, v zimním období neposkytují použitelné výsledky. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologicke biotesty s producenty • Testy s cévnatými rostlinami -jsou typickými testy pro hodnocení terestrických ekosystémů (orná půda, lesní půdy, hodnocení kompostů, tuhých odpadů, pesticidů apod.). Testy toxicity s cévnatými rostlinami 1 Testy s bylinami (nej častej i jednoleté, do 30 dnů po vyklíčení), nebo dřevinami (lesní kultury, aktivita mykorhyzy, genetické změny schopnosti syntetizovat kurikulu - obrana před imisemi, genotoxické efekty) Testy toxicity s cévnatými rostlinami 2 Testy s plevelnými druhy zde rozlišujeme tzv target species - tedy ty, které mají být např. herbicidy omezeny (oves hluchý, metlice chundelka, svlačec rolní, pýr plazivý apod.) a tzv. non-target species, které mají být nepoškozeny , versus testy s kulturními plodinami (kukuřice, pšenice, cukrová řepa, ovocné sady, vinice apod. Testy toxicity s cévnatými rostlinami 3 Testy cílené na jednodelozné (např. traviny) a dvouděložné - ( řepa, konopí, sady, listnaté lesy) - toto kriterium je důležité např. při vývoji herbicidů. Testy toxicity s cévnatými rostlinami 4 Dle zdroje matečného testovacího organismu dělíme testy s cévnatými rostlinami na testy využívající semena (nejčastější způsob), dále využívající cibule a hlízy (např. ASTM test s Alium cepa) a metody využívající vegetativně množený matečný materiál (Lemna, Elodea). Testy toxicity s cévnatými rostlinami 5 Dle způsobu experimentálního uspořádání dělíme na testy využívající extrakt na filtračním papíru v petriho misce (nejméně přirozený, ale často používaný způsob), dále přímý kontakt sedimentu, odpadu, nebo zeminy s klíčící rostlinou v petriho misce či květináči v prvních 2-6 týdnech po vyklíčení, a konečně nádobové pokusy postihující celý životní cyklus rostliny Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s producenty 1 • Rasy a sinice hodnotíme většinou pomocí změny počtu buněk v čase experimntu ve srovnání s kontrolou. • Alternace: - koncentrace pigmentů (např. chlorofylu a), - fyziologické aktivity (příjmu živin) a metabolické aktivity (fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity) Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s producenty 2 • Lišejníky hodnotíme dle: - struktury přirozených společenstev BI - metabolické aktivity přírodních a exponovaných (transplantovaných) druhů EB - dle morfologických - fytopatologických změn na stélce BI - dle bioindikačních hodnot (citlivých a toxitolerantních taxonů) BI. Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s producenty 3 • Qkřehek a submerzní vegetace- - počet nových lístků, - hmotnost, - defekty tvorby chlorofylu, nepřirozené tvary a celou škálu biochemických parameru (esterázy, dehydrogenázy, SOD, glutation, RUBISCO, až po metody využívající zobrazování a kinetiku fluorescence chlorofylu pomocí CCD- FLIA Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s producenty 4 - cévnaté rostliny • měřením délky kořene, hypokotyle, popřípadě nadzemní části rostliny a plochy listů. - běžné, ale ne nejcitlivější. • hmotnost žívá/ sušina nadzemní biomasy, kořene a její sušinu, • defekty chlorofylu, nekrózy a další pozorované abnormality. • aktivity dehydrogenáz, fosfatáz, oxidáz nebo peroxidáz, popř. syntézy glutationu. Způsoby vyhodnocování používaných pro EB s producenty -cévnaté rostliny • V případě nádobových pokusů hodnotíme - dobu nutnou k dosažení fenologických fází (např. odnožování, sloupkování, metání, kvetení, zrání semen, - klíčivost semen, - odolnost proti chorobám a škůdcům ve srovnání s kontrolou apod. • V případě lesních dřevin hodnotíme - přírůstky, - odolnost proti chorobám a škůdcům, - fotosyntetickou aktivitu, - ovlivnění syntézy kutikuly, - přítomnost a aktivitu mykorhyzy atd. Možnosti využití producenů pro různé typy ekotoxikologických testů Stanovení toxických efektů - letalita, inhibice růstu, nebo fyziologických procesů. Genotoxicita, mutagenita. Možnost použít řasy a cévnaté rostliny pro detekci chromozómových zlomů, tvorby mikrojadérek, iniciace nádorů na kořenech, poruchy tvorby kutikuly, mutace na úrovni intaktní rostliny, tvorba DNA aduktů atd. Hodnocení detoxifikační aktivity, přítomnost a aktivita detoxifikačních systémů ( PCR, ELFO, LC-MS, formy glutationu, SOD apod. • Hodnocení vlivu toxikantů na rezistenci k patogenním organismům • Využití fototrofních organismů pro hodnocení biokumulací a biokoncentrací toxikantů v přírodním prostředí. • Hodnocení podílu autotrofních organismů na detoxifikaci/ imobilizaci toxických látek v životním postředí (bioremediace pomocí cévnatých rostlin, nebo cyanobakterií) Test inhibice růstu Lemna minor OECD Lemna sp. Growth inhibition test (New Guideline Draft 2001) Testovací organismus: Lemna minor, Lemna gibba, tvořeny 2-5 lístky, Podmínky testu: 24±°C, expozice 7 dní, 100 ml vody v 150ml kádinkách 10 lístků/opakování, (9-12 - všude stejně) 6-10 000 lux, statický, pH 6,5, v průběhu testu kontrolujeme pH, teplotu Vyhodnocení: Rychlost růstu, hmotnost biomasy, počet lístků, Validace Výsledky testu jsou považovány za platné, když: • Průměrný počet lístků v kontrole vzrostl 8x • pH se nezměnilo po dobu testu více než o 1,5 • 168 IC 50 pro dvojchroman draselný je 10-60mg/L Test inhibice růstu kořene SinapiS alba dle vyhlášky MŽP ČR 33811997 Sb. OECD 208 Terrestrial (non target) Plant test Testovací organismus Sinapis alba, Lactuca sativa, Lepidium sativum, Hordeum vulgare, Zea mays Kulturní, plevelné Jednoděložné dvouděložné Klíčivost 90% Podmínky testu: 20± °C, 5ml/ PM 10-14 cm, 30 semen/ PM, expozice 72 h, 2-3 paralelní testy, inkubace ve tmě - termostat, filtrační papír. Vyhodnocení: podle normy • délka kořene, počet vyklíčených semen o alternativně • délka, tvar a hmotnost kořene a hypokotylu, defekty tvorby chlorofylu na světle, množství chlorofylu, aktivity enzymů, aktivita PSU. Validace Výsledky testu jsou považovány za platné, když: • klíčivost v kontrole je alespoň 90% • Zjištěná koncentrace LC 50 je v souladu se standardy