EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY S PRODUCENTY (ÚVOD DO BLOKU PŘEDNÁŠEK) Blahoslav Maršálek RECETOX, Kamenice 126/3, 625 00 Brno a Botanický ústav AVČR, Květná 8, 603 65 Brno, Marsalek@brno.cas.cz Terminologická poznámka: v hektické době překladů odporných termitů překladatelskými společnostmi ze světové literatury do češtiny se lze v současné době setkat s různým způsobem používanými termíny fytotoxicita a fytotoxiny. Ekotoxikologické biotesty využívající producenty (fotoautotrofní organismy) lze označit také jako testy fytotoxicity. Fytotoxiny v původním významu tohoto termínu nejsou látky toxické proti fotoautotrofním organismům (podstatně lepší termín v tomto případě je označení látky herbicidní) ale fytotoxiny jsou toxiny produkované rostlinami (alkaloidy, glykosidy, antibiotika atd.). Tato terminologie je mezinárodně ustálená, takže stejně jsou chápány mykotoxiny (toxiny produkované plísněmi a houbami), cyanotoxiny (toxiny produkované sinicemi) apod. Přehled základních typů organismů používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty Mezi tyto testy řadíme všechny biotesty, které používají producenty (fotoautotrofní organismy) . Patří sem zejména: * Sinice (fotosyntetizující gramnegativní eubakterie) koloniální (Microcystis), vláknité (Anabaena, Nostoc) a pikocyanobakteria jednobuněčné (Synechocystis). Dusík fixující sinice jsou velmi citlivé na toxické látky a inhibice nitrogenázy patří mezi vhodné endpointy. * Řasy ­ jednobuněčné, cenobiální, vláknité, sladkovodní, mořské. Podrobněji viz článek Řasové testy trofie a toxicity v tomto sborníku. Kromě klasických biotestů s jednou řasou, jsou používány tzv. Multispecies algal asays (paralelní kultivace zástupců zelených řas, sinic a rozsivek dle podmínek zkoumané lokality), nebo fyziologické testy (hodnocení fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity, nebo rozmnožovací aktivity) přírodních populací fytoplanktonu. Opomíjené v ČR, ale v zahraničí pro ekotoxikologické studie ceněné jsou biotesty s perifytonem a fytobentickými společenstvy, které lze využít také pro biochemickou ekotoxikologii a pro studium bioakumulace toxikantů. * Mechy a lišejníky - tyto metody jsou přehledně popsány v příspěvku Dr. Petra Anděla v tomto sborníku. Využívány jsou jednak bioindikační postupy s přirozenými společenstvy lišejníků, nebo s tzv. transplantovanými druhy, u kterých známe stáří a historii. Předmětem hodnocení endpointy, viz ANDĚL (2003) v tomto sborníku. V případě mechů nejsou propracovány metodiky ekotoxikologického hodnocení tak podrobně jako v případě lišejníků, ale např. vodní mech Fontinalis je využíván jako producent s vysokým potenciálem pro bioakumulaci kovů. * Okřehek a submerzní vegetace- Mezi nově navrhovanými metodikami OECD je v praxi již dlouho používaná metoda OECD 221 Lemna sp. Growth Inhibition Test (Draft New Guideline, ). V některých laboratořích je také pouřívána Spirodela polyrhyza, ale dle našich zkušeností je Lemna minor citlivější, než Spirodela. Dále je využívána Elodea canadensis a Myriophyllum sp. Jejich nevýhodou je sezónnost použití, která je omezena na květen až říjen, v zimním období neposkytují použitelné výsledky. ˇ Testy s cévnatými rostlinami ­ jsou typickými testy pro hodnocení terestrických ekosystémů (orná půda, lesní půdy, hodnocení kompostů, tuhých odpadů, pesticidů apod.). Existuje velké množství testů s cévnatými rostlinami a proto předkládám pro orientaci zjednodušený přehled: Testy s bylinami (nejčastěji jednoleté, do 30 dnů po vyklíčení), nebo dřevinami (lesní kultury, aktivita mykorhyzy, genetické změny schopnosti syntetizovat kutikulu ­ obrana před imisemi, genotoxické efekty) Testy s plevelnými druhy zde rozlišujeme tzv target species ­ tedy ty, které mají být např. herbicidy omezeny (oves hluchý, metlice chundelka, svlačec rolní, pýr plazivý apod.) a tzv. non-target species, které mají být nepoškozeny , versus testy s kulturními plodinami (kukuřice, pšenice, cukrová řepa, ovocné sady, vinice apod. Testy cílené na jednoděložné ( např. traviny) a dvouděložné ­ ( řepa, konopí, sady, listnaté lesy) ­ toto kriterium je důležité např. při vývoji herbicidů. Dle zdroje matečného testovacího organismu dělíme testy s cévnatými rostlinami na testy využívající semena (nejčastější způsob), dále využívající cibule a hlízy (např. ASTM test s Alium cepa) a metody využívající vegetativně množený matečný materiál (Lemna, Elodea). Dle způsobu experimentálního uspořádání dělíme na testy využívající extrakt na filtračním papíru v petriho misce (nejméně přirozený, ale často používaný způsob), dále přímý kontakt sedimentu, odpadu, nebo zeminy s klíčící rostlinou v petriho misce či květináči v prvních 2-6 týdnech po vyklíčení, a konečně nádobové pokusy postihující celý životní cyklus rostliny Přehled vybraných způsobů vyhodnocování používaných pro ekotoxikologické biotesty s producenty * Řasy a sinice hodnotíme většinou pomocí změny počtu buněk v čase experimntu ve srovnání s kontrolou. Alternace jsou pomocí koncentrace pigmentů (např. chlorofylu a), fyziologické aktivity (příjmu živin) a metabolické aktivity (fotosyntetické aktivity, enzymatické aktivity ) * Lišejníky hodnotíme dle struktury přirozených společenstev, metabolické aktivity přírodních a exponovaných (transplantovaných) druhů, dle morfologických ­ fytopatologických změn na stélce, dále dle bioindikačních hodnot (citlivých a toxitolerantních taxonů). * Okřehek a submerzní vegetace- nejčastěji je počítán počet nových lístků, ale alternativně lze hodnotit hmotnost, defekty tvorby chlorofylu, nepřirozené tvary a celou škálu biochemických paramerů (esterázy, dehydrogenázy, SOD, glutation, RUBISCO, až po metody využívající zobrazování a kinetiku fluorescence chlorofylu pomocí CCD fluorescenční kamery- viz Gavel a Maršálek v tomto sborníku). * Testy s cévnatými rostlinami mají desítky způsobů vyhodnocení, které se řídí především cílem realizovaného testu.Vyhodnocení probíhá většinou měřením délky kořene, hypokotyle, popřípadě nadzemní části rostliny a plochy listů. Toto měření je však jen jedna z možností a dle našich zkušeností ne ta nejcitlivější. Dále je vhodné měřit hmotnost živé nadzemní biomasy a její sušinu, hmotnost živé biomasy kořene a jeho sušinu, do protokolu je vhodné uvádět defekty chlorofylu, nekrózy a další pozorované abnormality. Test toxicity na cévnatých rostlinách lze vyhodnocovat také pomocí aktivit dehydrogenáz, fosfatáz, oxidáz nebo peroxidáz, popř. syntézy glutationu. V případě nádobových pokusů hodnotíme také dobu nutnou k dosažení fenologických fází (např. odnožování, sloupkování, metání, kvetení, zrání semen, klíčivost semen , odolnost proti chorobám a škůdcům ve srovnání s kontrolou apod. V případě lesních dřevin hodnotíme přírůstky, odolnost proti chorobám a škůdcům, fotosyntetickou aktivitu, ovlivnění syntézy kutikuly, přítomnost a aktivitu mykorhyzy atd. Možnosti využití producenů pro různé typy ekotoxikologických testů * Stanovení toxických efektů ­ letalita, inhibice růstu, nebo fyziologických procesů. * Genotoxicita, mutagenita. Možnost použít řasy a cévnaté rostliny pro detekci chromozomových zlomů, tvorby mikrojadérek, iniciace nádorů na kořenech, poruchy tvorby kutikuly, mutace na úrovni intaktní rostliny, tvorba DNA aduktů atd. * Hodnocení detoxifikační aktivity, přítomnost a aktivita detoxifikačních systémů ( PCR, ELFO, LC-MS, formy glutationu, SOD apod. * Hodnocení vlivu toxikantů na rezistenci k patogenním organismům * Využití fototrofních organismů pro hodnocení biokumulací a biokoncentrací toxikantů v přírodním prostředí. * Hodnocení podílu autotrofních organismů na detoxifikaci/ imobilizaci toxických látek v životním postředí (bioremediace pomocí cévnatých rostlin, nebo cyanobakterií) Závěr Cílem tohoto úvodního článku nebylo podat ucelený přehled testů toxicity s producenty, ale nastínit možnosti hodnocení toxických účinků na fotoautotrofní organizmy v ekotoxikologických souvislostech. Především však bylo cílem tohoto přehledu uvést do bloku přednášek, které by měly připomenout, že ekotoxikologické biotesty a producenty dnes již nejsou jen testy na řasách v E-láhvích a klíčení hořčice v petriho miskách, ale že jsou propracovány standardní operační procedury pro celou řadu alternativních testů, které mají určité výhody (jsou citlivější, rychlejší, levnější, relevantnější pro určitý typ vzorků a sledovaných lokalit apod.).