Metoda pro stanovení toxicity pro reprodukci u Daphnia magna Metoda C.20 dle přílohy směrnice 2001/59/ES Daphnia magna jako modelový organismus Ke zkoušce se používá druh Daphnia magna Straus (1820), neboli hrotnatka velká (vodní blecha) Říše Animalia (živočichové) - Kmen Arthropoda (členovci) - třída Branchiopoda (lupenonožci) - řád Cladocera (perloočky) - čeleď Daphniidae (hrotnatkovití) -rod Daphnia (hrotnatka) • 3-5 mm dlouhý, převážně planktonický sladkovodní živočich • dospívají během 6-10 dní, množí se partenogeneticky, životnost až 56 dní při 20°C Podstata metody Mladé samicí dafnie se exponují zkoušené látce Zkouška trvá 21 dní Nedospělí jedinci pocházející z dospělých dafnií, které uhynuly se vyloučí Reprodukční schopnost exponovaných organismů se porovná s kontrolní skupinou Testovací organismy Daphnia magna Straus (1820) Identifikace klonu nejlépe uvedením genotypu Musí pocházet ze zdravé kultury Zásobní kultura se musí chovat v podmínkách podobných zkoušce Zkušební médium Eleandtova média M4 a M7, popř. jiná validní Doporučuje se stanovit celkový organický uhlík (TOC) - v médiu (před přidáním řas) by TOC měl být nižší než 2mg/l M4 a M7 se nedoporučují pro testy látek obsahující kovy -> jiné média Rozpuštěný 02 > 3mg/l, pH mezi 6 a 9 (±1.5) Obnovování zkušebního média Častost obnovy závisí na stálosti zkoušené látky, alespoň však 3x týdně Při nestálosti koncentrace zkoušené látky by mělo být zváženo častější obnovování média nebo průtoková zkouška Informace o zkoušené látce Zdroj informací jsou výsledky zkoušky akutní toxicity Nutná je spolehlivá analytická metoda kvantitativního stanovení látky ve zkušebních roztocích Strukturní vzorec, čistota látky, stálost na světle, rozpustnost a výsledky zkoušky snadné biologické rozložitelnosti Zkušební roztok a zkušební koncentrace ZR se připravuje ředěním zásobního roztoku, který se připravuje nejlépe rozpuštěním látky ve zkus. médiu Někdy použití rozpouštědel a dispergatoru (aceton, methanol, ethanol; Cremophor RH40,HCO-40) Rozpouštědla a dispersanty do 0.1ml/l, lépe je nepoužívat Zkušební roztok a zkušební koncentrace II Zkušební koncentrace se připravuje alespoň v pěti variantách s faktorem <3,2 (geometr, řada) cn = c0 * qn n = 1,2,3,... Rozptyl koncentrací se nastavuje podle cíle testu: ■ LOEC/NOEC ■ ECX Nepoužívá se koncentrace se stát. významným účinkem na přežití dospělců -> toxicita pro reprodukci a mortalitu Uspořádaní zkoušky Expozice se rozvrhuje pro jednotlivé zkušební nádoby Poté náhodný přístup k obsluze nádob Při ovlivnění počátečními nebo okolními podmínkami, by mělo být zváženo jiné uspořádání zkoušky (blok) Podmínky expozice Nasazování organismů Počet organismů Krmení Další aspekty chovu Nasazování a počet organismů Po jednom organismu do nádob s 50 - 100 ml média U semistatickych zkoušek jednotlivě pro každou koncentraci 10 organismů U průtokových zkoušek se navrhují jiné uspořádání - po skupinách Krmení Nejlépe denně, avšak alespoň třikrát týdně Živé buňky řas jednoho nebo více druhu: Chlorella sp., Pseudokirchneriella subcapitata, Scenedesmus subspicatus Stačí dodávat 0.1 - 0.2 mg C/dafnie za den Při určení potřebného množství stravy zástupným ukazatelem se tvoří nomogram Další aspekty chovu Osvětlení- 16 hod. s intenzitou do 15 - 20uE/m2s Teplota - 18 - 22°C, ne však kolísání o více jak 2°C Provzdušňování - nesmí se provzdušňovat Kontrolní skupina Nasazuje se jedna série kontrolních skupin pro kontrolu zkušebního média Dle potřeby - jedna série kontrolních skupin obsahujících rozpouštědlo nebo dispergator Potomstvo, mortalita a další parametry Potomstvo se nejlépe každý den vybírá a počítá Mortalita matečných organismů se zaznamenává současně s počítáním potomstva Je možno zároveň pozorovat a měřit i jiné účinky, než je samotná reprodukce. - měření délky matečných organismů na konci zk. - doba narození prvních plůdků - velikost a počet potomků jednoho organismu - počet potracených plůdků,... Četnost měření Jednou týdně: 02, teplota, tvrdost a pH v médiu, kontrolních nádobách a u nejvyšší zkušební koncentrace. U statické koncentrace zkoumané látky (±20%) se měří nejvyšší a nejnižší hodnoty na začátku při přípravě a při obnovování vzorku Při zkouškách s nepředpokládanou statickou koncentrací se analyzují všechny koncentrace ihned po jejich přípravě a při obnovování