FETAX
Frog Embryo Teratogenesis Assay- Xenopus
podle metodiky ASTM E 1439-98: Standard Guide for Conducting the Frog Embryo
Teratogenesis Assay-Xenopus (FETAX).
•    Laboratorní test pro odhad rizika embryotoxicity a teratogenity chemických látek a enviromentálních směsí v roztoku
•    Akutní, semistatický test
•    využívaný organismus
- Xenopus laevis (drápatka vodní) čeleď Pipidae
vajíčka
po 96h expozici se hodnotí změny
ve vývoji embrya v porovnání s kontrolou
•    Stanovení jedné chemické látky se provádí na třech nezávislých měření s různými rodičovskými páry
Laboratorní chov
•    Skleněné nebo plastové nádoby, výška aspoň 30cm
•    voda - dechlorovaná nebo přírodní
- výška hladiny 7-14cm
- teplota 23±3°C, pH < 7
- provzdušňování u mladých jedinců
•    Fotoperioda 12h den/12h noc
•    Krmení 2-3krát týdně, následně výměna vody
- směs mletého hovězího masa (játra,srdce, plíce)
- doplnění o vitanímy
Průběh testu
•   Před založením testu
- stimulace jednoho rodičovského páru hormonem
choriogonadotropinem (den před snůškou)
injekčné do zadního lymfatického vaku samice 500-1000 IU, samec 250-500 IU
následná stimulace stejného jedince nejdříve po 90 dnech
- pár do samostatné nádrže - provzdušnění, teplota vody 21±2°C
amplexus po 2-6h
kladení vajíček po 9-12h od injekce
- do testu vybíráme vajíčka kulatého tvaru, nakladena jednotlivě
—► co nejkvalitnější, oplozená
- dobrá snůška: < 75% oplozených vajíček
•    Fetax médium
625 mg NaCI, 96 mg NaHC03, 30 mg KCl, 15 mg CaCI3, 60 mg CaS04-2H20, 75 mg MgS04 na litr destilované vody
- se připravuje čerstvé, s důrazem na správné pH, (pH 7,6-7,9)
•    Založení testu
- 5 h po fertilizaci, nutné před započetím neurulace
25 vajíček na Petriho misky + 10ml fetax média + testovaná látka koncentrační řada, každá koncentrace > 2misky
negativní kontrola > 4 misky
- referenční materiál: pozitivní kontrola 6-aminonicotinamid
all-trans retinová kyselina (ATRA)
•   Průběh testu
- teplota 24±2°C (nižší zpomalí vývoj, vyšší znásobí výskyt malformací)
- pH 7,7 (reálně mezi pH 6,5 a pH 9,0)
- náhodné uspořádání misek v prostoru
- výměna média a odběr uhynulých embryí po 24,48, 72 hodinách
- ukončení testu po 96h, 90% embryí by mělo dosáhnout 46.stádia vývoje
46.stádium
•   Závěr testu a vyhodnocení
- fixace embryí ve 3% formaldehydu
- vyhodnocení pod mikroskopem
Výsledky po ukončení 96h expozice:
- LC50   - koncentrace způsobující 50% úhyn embryí
- EC50   - koncentrace způsobující malformace u 50% embryí
- teratogenní index TI - hodnota podílu 96h LC50 a 96h EC50
- MCIG - minimální koncentrace způsobující inhibici růstu
Další endpointy:
-zpomalení vývoje
- inhibice růstu
- malfornace orgánu
- biochemické markery -změny chování