Metoda pro stanovení toxicity na rybích embryích a potěru - krátkodobá zkouška - metoda C15 podle přílohy směrnice 2001/59/ES Při této zkoušce jsou exponována životní stádia ryb od čerstvě oplodněných jiker do stádia váčkových plůdků Replika metody OECD TG 212 Tato zkouška je určena k zjištění letálních a v omezené míře i subletálních účinků chemických látek na specifická stádia a testovací druhy Měla by poskytnout užitečné informace, neboť by Mohla být přechodem mezi letálními a subletálními zkouškami Mohla by být použita jako screeningová zkouška pro úplnou zkoušku toxicity na časných vývojových stádiích nebo pro zkoušky chronické toxicity Očekává se, že zkouška na embryu a váčkovém plůdku je méně citlivá než úplná zkouška na časných vývojových stádiích, zejména pokud jde o vysoce lipofilní chemické látky (logP 0/v > 4) a chemické látky se specifickým mechanismem účinku. Menší rozdíly se očekávají v případě látek s nespecifickým, narkotickým mechanismem účinku Nejvíce zkušeností s touto zkouškou je získáno u sladkovodní ryby Brachydanio rerio- Danio pruhované. Lze ovšem použít i jiné druhy jako Pstruh duhový, Kapr obecný, Karas zlatý, sleď a další... Princip testu Expozice oplodněných jiker ve zkušebních nádržích Ukončení testu těsně před tím, než dojde k úplné absorpci žloutkového váčku (nejsou krmeny) Embrya a váčkové plůdky jsou exponovány různým koncentracím testované látky (obvykle 5) Posouzení letálních a subletálních účinků a jejich porovnání s kontrolními hodnotami s cílem určit LOEC a NOEC • Případně analýza za použití regresního modelu s cílem odhadnout koncentraci, která způsobuje určitý procentuálně vyjádřený účinek tj. LC/ECX Pracovní postup Výběr vhodného počtu zdravých ryb a jejich udržování alespoň dva týdny před předpokládaným třením ve vhodné vodě Po tření přenos oplodněných jiker bez přístupu vzduchu do zkušebních nádrží Zahájení nejlépe do 30 min. po oplodnění jiker. V každém případě před počátkem stádia gastruly (Mikroskopické vyšetření jiker, aby se ověřilo, že v prvních stádiích vývoje nedošlo k nepravidelnostem) Náhodné rozdělení jiker k expozici a na jednu koncentraci alespoň 30 ks rovným dílem mezi alespoň tři další zkušební nádrže Pracovní postup Velikost násady by měla být tak nízká, aby bylo možné udržet koncentraci rozpuštěného kyslíku bez provzdušňování na alespoň 60% Fotoperioda a teplota vody by měly vyhovovat zkušebnímu druhu Optimální hodnoty pH a tvrdosti vody jsou 7.8 a 250 mg/l, vyjádřeno jako CaC03 Zkouška umožňuje volit mezi semistatickým a průtokovým uspořádáním (závisí to na povaze zkoušené látky) • Pozorování: - co nejpřesnější identifikace stádia gastruly na začátku expozice - líhnutí a přežívání alespoň lx denně (každých 30 min. během prvních tří hodin) - odstranění uhynulých embryí a plůdků - zaznamenávání plůdků s neobvyklým tělesným vzhledem nebo pigmentací - zaznamenávání neobvyklého chování - na konci zkoušky se zaznamenává tělesná délka (standardní/celková) a hmotnost (doporučuje se hmotnost za sucha - 24h při 60°C) Vyhodnocení Dvojfázový přístup. 1.statistická analýza dat o mortalitě, nenormálním vývoji a době líhnutí. 2. u koncentrací u kterých nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky na tyto parametry se statisticky vyhodnotí délka (toxická látka může selektivně usmrcovat menší ryby, prodlužovat délku líhnutí a indukovat makroskopické malformace a tedy zkreslovat délku- zajistí to validitu statistiky zkoušky) Pro stanovení hodnot LOEC/NOEC analýza odchylky pro každou sadu paralelních skupin pomocí analýzy variace (ANOVA) Stanovení LC™ a ECcn Validita zkoušky Má-li být zkouška platná, musí být splněny následující podmínky: - celková míra přežití oplodněných j i ker v kontrolních skupinách (případně i v nádržích s přidaným rozpouštědlem) musí být vyšší nebo rovna stanoveným limitům pro testovaný druh - koncentrace rozpuštěného kyslíku musí ležet mezi 60 a 100 % nasycení vzduchem po celou dobu zkoušky - teplota vody se po celou dobu zkoušky nesmí mezi zkušebními nádržemi nebo den ode dne lišit o víc než ± 1,5°C a měla by být udržována v rozpětí teplot stanoveném pro zkušební druh - koncentrace testované látky nesmí klesnout pod 80% ZKUŠEBNÍ PODMÍNKY, DÉLKA ZKOUŠKY A KRITÉRIA PŘEŽITÍ PRO DOPORUČENÉ DRUHY Druh Teplota (°C) Salinita (%o) . Fotoperioda 00 Délka stádií (d) Typická délka zkoušky Přežití v kontrolních skupinách (minimální hodnota v %) Embryo Váčkový plůdek Úspěšnost líhnutí Po vylíhnutí SLADKOVODNÍ • • Brachydamo rerio Danio pruhované 25±1 — 12-16 3-5 • 840 Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 5 dnů po vylíhnutí (8-10 dnů) 80 90 Oticorhynchus mykiss Pstruh duhový 10 ± 1 (1) 12 ±1(2) — 0(3) 30-35 25-30 Pokud možno ihned od oplodnění (od Časného stádia gastruly) do 20 dnů po vylíhnutí (50-55 dnů) 66 70 Cyprinus carpio Kapr obecný 21-25 — 12-16 5 >4 Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů) 80 75 Oiyzias latipes Halančík japonský 24 ± 1 (1) 2-3 ± 1 (2) — 12-16 . 8-11 4-8 Pokud možno ihned od oplodnění (od časného stádia gastruly ) do 5 dnů po vylíhnutí .(13 -16 dnů) 80 80 Pimephales promel as Střevle 25±2 — 16 4-5 5 Pokud možno ihned od oplodnění (od časného. stádia gastruly) do 4 dnů po vylíhnutí (8 - 9 dnů) 60 70