Experimentální modely
ekotoxicity pro
bezobratlé živočichy
Využití standardních testů
>  Hodnocení vlastností nebezpečných pro životní prostředí
- u chemických látek a přípravků
- u přípravků na ochranu rostlin (pesticidy)
- u biocidních přípravků a účinných látek
>  Stanovení ekotoxicity odpadů
>  Hodnocení léčiv určených do vodního prostředí (pro ryby) za účelem jejich registrace
>  Biologické testování přítokových a odpadních vod
>  Biologická zkouška toxicity při haváriích
>  Testování látek s potenciálním dopadem na vodní ekosystémy
Bezobratlí živočichové
•   Přítomnost a aktivita bezobratlích je naprosto rozhodující pro stav ekosystému.
•   Bezobratlé najdeme ve všech ekosystémech.
•   Vodní bezobratlí tvoří významnou část celkové biomasy, mají nepoměrně vyšší druhovou bohatost oproti obratlovcům.
•   Hrají významnou roli v potravním řetězci jako destruenti, ale i konzumenti prvního a druhého řádu, s čímž je spojená možná bioakumulace.
•   Díky změnám habitatu při metamorfóze mohou zasahovat do více ekosystémů i během jednoho životního cyklu, díky čemuž mohou přijímat široké spektrum polutantů a přenášet je mezi jednotlivými ekosystémy.
><L> Oh
O
o
c/3 CD
H
CD O
f
o
CD
2

'.C^W
>N
TERESTRICKÉ PROSTŘEDÍ
Půdní testy s bezobratlími
Uspořádání: umělý substrát, vlhčená petriho miska, standardní nebo přírodní půda - různé nádoby... - zpravidla 14 dní (letalita), 56 dní - reprodukce ...
Organismy
Červi (kroužkovci - žížaly, háďátka, roupice)
Chvostoskoci (Collembola)
TERESTRICKÉ PROSTREDI - konzumenti - bezobratlí
Zejména pro testování biocidů
VČELY
- testování insekticidů
- dávkování v potravě
Moucha domácí
{Slum u «niiy dt MbrwKa UJo*patlmtttí of Entomology
Drosophila
(hodnocení genotoxicity)
Testy toxicity na vodních bezobratlích
Normy testů na bezoobratlích:
ČSN EN ISO, OECD, ASTM, US EPA, TNV, EEC, AFNOR
Testy na korýších (Crustacea) - planktonni - nejčastější
Daphnia magna, D. pulex, Ceriodaphnia dubia, Artemia šalina (mořská),
Thamnocephalus platyurus
Testy na vířnících (Rotifera) - Brachionus calyciflorus Testy na kroužkovcích (Annelida) - Tubifex tubifex
Testy na hmyzu (Insecta) - Chironomus tentans
Testy na měkkýších (Mollusca)
Potamopyrgus antipodarum
Testy na bentických korýších (Crustacea)
Gammarus, Hy all el a azteca
Daphnia magna
Ceriodaphnia dubia
Gammarus
Artemia šalina
Chironomus riparius
Hrotnatka velká {Daphnia magna)
Řád: Cladocera (perloočky):
Daphnia pulex (hrotnatka obecná), D. magna (h. velká)
•  zástupce zooplanktonu
• akutní i chronické testy
• běžně používaný modelový organismus
(OECD 1984)                     _ citlivost k toxikantům
- rychlá reprodukce
- determinované toxikologické parametry
- rychlý životní cyklus
- snadná kultivace
- biochemické markery
Normy testů s Daphnia magna
•    ČSN ISO 6341 (75 7751) Jakost vod - Zkouška inhibice pohyblivosti Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Zkouška akutní toxicity
•    ČSN ISO 10706 (75 7752) Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
•    ISO 6341/1996 Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test
•    ISO 1070/2000 Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
•    OECD 202 Daphnia sp. Acute Immobilisation Test   (Updated Guideline, adopted 4th April 1984)
•    OECD 211 Daphnia magna Reproduction Test (Original Guideline, adopted 21st September 1998)
Permanentní laboratorní chov Daphnia magna
•   kultivační místnost
•  stálá teplota 20 ± 2°C
•   stálá fotoperioda 16h světla/8h tmy
•   stálé pH
•   kultivační médium M4
•   pravidelné krmení směsí řas
Akutní test na Daphnia magna
Podmínky akutního testu:
20±2 °C, expozice 24/48 h, bez aerace, bez osvětlení (max 12h lOOOIux), bez krmení
nádobka l-5ml/ks (30 jamková destička (10 ml))
20 ks/ Ikoncentrace - (4x5ml/5ks), 5 organismů na jamku standardní médium (CaC03, MgS04, NaHC03, KCl) organismy mladší 24h
během testu měříme pH, teplotu, 02
sledovaný parametr: imobilizace po 24, 48 hodinách - počítáme mobilní jedince
- kriterium imobilizace: jedince, kteří nejsou schopni se rozplavat ani po 15s mírném zamíchání považujeme za imobilizované, i kdyby ještě pohybovaly tykadly
ALTERNATIVNÍ MIKROBIOTESTY ("toxkitv") s bezobratlími
www. microbiotests. be
*Test organisms are included in the kits as "dormant eggs (cysts) " which can he hatched "<>}i demand'
ROTOXKIT F
chronic
Contains all the materials to
perform three
48h reproduction assays
THAMNOTOXKIT F™
MICROBIOTESTS
With the
crustacean
Thamnocephalus
platyurus
PROTOXKIT F™
MICROBIOTESTS
With the ciliate
protozoan
Tetrahymena
thermophila
MIKROBIOTESTY
http://www.microbiotests.be/
•   Výhody: miniaturizace, zkrácení doby inkubace a tím i zjednodušení
•   Možnost dlouhodobého uchovávání testovacích organizmů ve formě kryptobiotických klidových stádií,
v lyofilizováném nebo imobilizováném stavu.
•   Organizmy se před použitím v testech uvedou do aktivního stavu.
•    Synchronně vy líhli j edinci j sou uniformní a pocházej í z geneticky přesně definovaných zásobních kultur.
•   V současnosti jsou mikrobiotesty komerčně dostupné v podobě tzv. toxkitů
MIKROBIOTESTY
DAPHTOXKIT FTM magna, DAPHTOXKIT FTM pulex: 24-48h test akutní toxicity pro korýše Daphnia magna a Daphnia pulex fbdpovídá OECD a ISO normám)
CERIODAPHTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Ceriodaphnia dubia (odpovídá USEPA normě)
THAMNOTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro korýše Thamnocephalus platyurus (Test s Thamnocephalem u nás normován TNO)
OSTRACODTOXKIT FTM: 6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. První kontaktní mikrobiotest pro kontaminované sedimenty nebo půdy
ROTOXKIT FTM: 24 h test akutní toxicity pro vířníka Brachionus calyciflorus (odpovídá standardní normě ASTM E1440-91).
ROTOXKIT FTMshort -chronic: 48h krátký-chronický (reprodukční) test s vířníkem Brachionus calyciflorus (odpovídá francouzské normě AFNOR)
PROTOXKIT FTM: 24h chronický (inhibice růstu) test toxicity pro prvoka Tetrahymena thermophila. Metodika pro odpovídající test je vyvíjena v OECD.
RAPIDTOXKIT (tm): Hodinový test toxicity s larvami korýše Thamnocephalus platyurus pro rychlou detekci kontaminace vody.
Mikrobiotesty
Thamnotoxkit
•    Testovací organismus Thamnocephalus platyurus
•    Uchovávání: klidová stádia
•    Doba líhnutí: 20 hod., 4000 lx, 20°C
•    Inkubace: 24 hod., 4000 lx, 20°C
•    Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50
Výhody: 20 h líhnutí, větší, citlivý organismus, expozice 24-48 h, srovnatelné výsledky s dafnií (+ citlivější) i zakalené/zabarvené vzorky, jev TNV
Obdobně CERTODAPHTOX
Ceriodaphnia dubia
ODVETVOVÁ TECHNICKÁ NORMA VODNÍHO HOSPODÁŘSTVÍ
MZeČR
MIKROMETODA STANOVENÍ AKUTNÍ TOXICITY NA KORÝŠI THAMNOCEPHALUS PLATYURUS
TNV 75 7754 Obsah                                                                                                                   Strana
1.                Předmluva.......................................................................................................        1
2.                Predmet normy..................................................................................................       2
3.                Termíny, definice a zkratky.................................................................................      2
4.                Podstata zkoušky...............................................................................................      3
5.                Materiály a chemikálie.........................................................................................      3
6.                Prístroje a pomůcky............................................................................................      4
7.                Príprava vzorků zkoušené vody...........................................................................     4
8.                Postup zkoušky....................................................................................................     5
9.                Vyjadřování výsledků............................................................................................    7
10.              Protokol o zkoušce...............................................................................................    7
11.              Příloha A (informativní) - Korýš Thamnocephalus platyurus..................................   8
12.              Přílohy B (informativní) - Limitní hodnoty pro Thamnocephalus platyurus.............   9
13.              Příloha C (informativní) - Literatura.......................................................................    10
Rotoxkit F
•   Testovací organismus:
Brachionus calycifloris (vodní vímík)
•    Uchování: klidová stádia, cysty
•    Doba líhnutí: 18 hod., 20°C, 4000lx
•    Design: 6 opakování, 6 koncentrací v jedné destičce, jamka á 0,3 ml
•    Inkubace: 24 hod., 20°C, 4000lx
•   Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50
Výhody: Domácí běžný druh, přídavná informace
Nevýhody: Malý, většinou méně citlivý
Závěr: zajímavý doplněk testů toxicity, není nutný, je-li v baterii korýš
Obdobně Protoxkit s prvokem Tetrahymena thermophila
u
+>
ta >i u

S1
>0 •H -P 10 4) •tí
*H U
O +>
-OOOOOO
-OOOOOO •OOOOOO -OOOOOO
■OOOOOO ■OOOOOO
«T-              Pi             ť>              -«.              q»
oooooo
c
t
3
VO
id
VI
id 'Q
s
ví
a
c/3
^°2
2
a
h-l
>
Plnění testovací destičky
O.Tml
0,3 ml
rw:
n           y           ^           ■           c            r
oooooo
rO'OOOOOO O'OOOOOO
oooooo oooooo
yooooooo
u
C1
tMtovací deatička
Přenos vířníků
do testovacích
jamek
	1     Přenos cca 50 vířníků do každé ředící jamky 5 vířníků v testovací					jamce	
						E D t DC DC DC DC DC	
OOOOOC (   >OOOOC C   )OOOOC (   )OOOOC U(_4_>QQQ0(							D D D D D
							
jamky pro test lihnuti       panika
Daphtoxkit pulex
Výhody
Jako ISO, OECD Z klidových stádií
Nevýhody
3 dny líhnutí
Nevyrovnané líhnutí
Problémy se skladováním
Povrchové tenze -neplavou
Závěr: zatím není zcela vyladěný
RAPIDTOXKIT
Test s nejrychlejší odpovědí
„jídelní test" - sledováno ovlivnění příjmu potravy stresem (toxickou látkou)
Testovací organismus: Thamnocephalus platyurus
Uchování: klidová stádia, cysty
Doba líhnutí: 30-45 hod., 25°C, 4000lx
Inkubace: 15-60min, 25°C, 4000lx
Pak přidány červeně obarvené mikrospory (potrava), inkubace 15-30 min
Vyhodnocení: pod mikroskopem zhodnocen příjem potravy v jednotlivých expozičních variantách -hodnocena inhibice příjmu mikrospor v porovnání s kontrolou
Suspected water
W
•:.•
Control water
Expose the test organisms (small lan'al crustaceans) hatched from dormant eggs to the suspected water and a control water, for a short period of time (15 minutes, to 1 hour)
Add red microspheres and allow the test organisms to lake up the particles during 15-30 minutes
Observe the coloration of the digestive tract of the larvae under a stereomicroscope
No uptake (or significantly decreased uptake) of the red microspheres points to the presence of « unwanted » compounds which should trigger attention and action
Y
E S
SL
N O
w
Toxic hazard ?
Testy toxicity na korýších/vířnících
VALIDITA: Výsledky testu jsou považovány za platné, když
•   Koncentrace  rozp.  kyslíku  neklesla  pod  60% nasycení
•   Koncentrace testované látky neklesla pod 80%
•   Mortalita kontrolního vzorku nepřesáhla 10%
•   Zjištěná   koncentrace   LC50   je   v   souladu   se standardy
PŮDA + SEDIMENTY
Mikrobiotest - OSTRACODTOXKIT FTM:
6 denní chronický test toxicity (mortalita/inhibice růstu) s korýšem Heterocypris incongruens. Kontaktní test v mikrodeskách 3x2 jamky (objem 1 ml). 10 j edinců na j amku,
iTM
Uchování: klidová stádia, cysty Doba líhnutí: 52 hod., 25°C, 40001x Inkubace: 6 dní, 25°C, 40001x Vyhodnocení: mortalita, 24 LC50, růst
OSTRACODTOXKIT F
MICROBIOTESTS
FOR SEDIMENT TOXICITY TESTING
With the
benthic crustacean
Heterocypris
incongruens
Testy toxicity s bezobratlými
Ekonomické hodnocení
(orientační ceny bez cla a dopravy)
•  Rotoxkit, Thamnoto.....................................1000KČ
•   Daphtoxkit..................................................1300KČ
•  Algaltoxkit..................................................4300KČ
•   ECHA Biocide monitor................................ 200KČ
•   MetPad.............................................. 500KČ
•  Toxichromotest (SedimentChromoPad), Toxichromotest....................................10OOKč
Testy toxicity sedimentů
Spíše chroničtější expozice - viz. Chronické testy - pakomáři, mlži, korýši, kroužkovci - Hyallela, Lumbriculus
Tubifex tubifex - Nitěnka obecná
kmen: KROUŽKOVCI třída: opaskovci podtřída: máloštětinatci
•     Součást makrozoobentosu
•     Relevantní organismus pro sediment
•     Inhibice pohybu a letální koncentrace
Akutní test
Učel: Test je určen k hodnocení akutní toxicity látek na nitěnky. Nitěnky patří mezi nejčastěji a nejdéle používané testovací organismy.
Princip: Test spočívá ve sledování chování a přežívání nitěnek v odstupňovaných koncentracích látky ve srovnání s kontrolou v ředící vodě. Expozice je 48 h. Možno i prologovaný 10-14 denní test
Hodnocené parametry: přežívání, aktivita, bioakumulace
Chronické testy s vodními bezobratlými živočichy
Akvatické testy
•    Reprodukční test s hrotnatkou Daphnia spp. (ISO 1070/2000)
•    Test přežívání a reprodukce s břichatkou Ceriodaphnia dubia (USEPA, 1989)
Sedimentové testy
10-denní test přežívání a růstu s ruznonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000)
42-denní test přežívání, růstu a reprodukce s ruznonožcem Hyalella azteca (USEPA, 2000)
10-denní test přežívání a růstu s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000)
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účiků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans (USEPA, 2000)
Test bioakumulace s máloštětinatcem Lumbriculus variegatus
ASTM E 1706 (2005) Standard Test Method for
Measuring the Toxicity of Sediment-Associated
Contaminants with Freshwater Invertebrates
•   korýš Hyalella azteca ( H. azteca)
•   pakomár Chironomus tentans
•    10 denní test, 300-mL kádinky, 100 mL sedimentu, 175 mL vody organismy krmeny
•   Parametry: přežívání, růst
Další testy sedimentů:
Chironomus riparius, Daphnia magna and Ceriodaphnia dubia, Hexagenia spp.,
Chronický test s Tubifex tubifex (28 dní) - přežívání, růst, reprodukce
Chronický test s H. azteca
Diporeia spp.
Chironomus dilutus - přežívání, růst, vylétávání, reprodukce
Chronický test na Daphnia magna
ČSN ISO 10706 Jakost vod - Stanovení chronické toxicity látek pro Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea)
h
organismy mladší 24h
10 organismů na koncentraci
individuálně v 50ml media M4/kádinku
médium výměna 3x týdně
expozice 21 dní teplota 20±2°C
pH 6-9 (±1,5)
fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy
krmení směs řas
Příprava média Elendt M4
Zásobní roztoky
SrCl2.6H20
MnCl2.4H20
ZnCl2
CoCl2.6H20
Na2Se03
CuCK.2H.O
H3BO3
LiCl
RbCl
NaBr
KI
NH4V03
CaCl2.2H20, NaHC03, NaN03 MgS04.7H20, KH2P04, KCl,   K2HP04, Na2Si03.9H20
Roztok I (stopové prvky)
Thiamin
hydrochlorid,
Biotin,
Cyanocobalamin
Roztok II. '(makroživiny
vitamíny)
Sledované parametry
Mortalita, přežívání
Reprodukce
Počet narozených juvenilů
Den první reprodukce
Chování - způsob pohybu
240 220 200 180 •g 160
C
HL 140
.c o
•^ 120
0) N
I 100
C
S  80
o
Q.
60
40
20
0
			koncentrace 15 mg/l				
							
							
							
							
							
							
	-•— control -■- BIOMASS						
	-♦- AQ.EXTRACT -*- C18 PERMEATE						
	-•- C18 ELLWTE						
							
							
							
							
							
							
							
							
				C			
10
12
14        16 čas (dny)
18
20
22
100
80
60
40
20
koncentrace 135 mg/l
^S
contorl BIOMASS AQ.EXTRACT C18 PERMEATE C18ELUATE
-♦—•-----♦-
8           10          12          14          16          18          20          22
čas (dny)
další efekty (zbarvení, tukové kapénky, velikost gonad)
Testy s larvami pakomárů rodu
Chironomus
•   OECD 218 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Sediment
•   OECD 219 Sediment-Water Chironomid Toxicity Test Using Spiked Water
•   USEPA 2000 Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účinků kontaminace sedimentů s pakomárem Chironomus tentans
Chironomus
riparius Meig. omár)
Sediment Toxicity Testing
10-denní test s larvami pakomáru rodu Chironomus
Nasazovány larvy ve stadiu 2-3 instaru (cca 10 d staré)
10 j edinců/kádinku
100 ml sedimentu/175 ml vody
Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost
Po 10 dnech hodnoceno přežívání a růst
Celoživotní (Life-cycle) test pro hodnocení účiků kontaminace sedimentů s pakomárem
Chironomus tentans
Nasazovány larvy mladší jak 24 h
Podobné uspořádání                 12 jedinců/kádinku
jako v 10-denním                100 ml sedimentu/175 ml vody
testu                                  Teplota 20 ± 2°C
Pravidelné krmení, vzduchování Fotoperioda 16 h světla / 8 h tmy Sledováno pH, kyslík, vodivost Doba expozice 50-60 d (ukončeno 7 dní po posledním vylétnutí)
Hodnocené parametry: 20-denní přežívání a váha (růst), vylétávání samiček a samečků - poměr pohlaví, doba vylétávání, počet nakladených vajíček, přežívání dospělců
Endokrinní disrupce (ED) = narušení hormonální rovnováhy organismů s potenciálními negativními následky pro celkovou homeostázu, reprodukční, vývojové a behaviorálních funkce
Projevy u bezobratlích:
Narušení reprodukce, rodivosti (fekundita)
Poruchy růstu, sexuálního dozrávání (maturace)
Narušení sexuálního dimorfismu, Intersex, Imposex
další procesy řízené hormony: pigmentace,
regenerace končetin, diapauza
Sagi et al. (2003) - Cherax quadricarinatus Rudolphi (1999) - Samastacus spiniformis
Suzuki (1999)
- Armadillidium vulgare
Jungmann et - Gammarus
al. (2004) fossarum
Barki et al. (2003)
SUBLETALNI TOXICITA U VODNÍCH MĚKKÝŠŮ
- vodní měkkýši využíváni jako testovací organismy pro vyhodnocení účinků endokrinních disruptoru ve vodním prostředí
Test sedimentů s písečníkem novozélandským
Potamopyrgus antipodarum
- vhodný a efektivní nástroj pro testování přírodních sedimentů a
čistých látek
- finančně atraktivní varianta oproti chemickým analýzám sedimentů
Parametry
iJ*otamopvrgu$ sediment testu46	
trvání	4 týdny (popř. 8 týdnů)
nádoba	objem 1 1
médium	800 ml vody
expozice	statická, 50 g sedimentu
odběry	20 jedinců po 4 (8) týdnech
parametry
mortalita; změny v morfologii pohl. orgánů; počet embryí, poměr embryí bez ulity a s ulitou
+ nízké nároky na kultivace
- nedostatečná velikost pro biochemické analýzy
Příprava
Typy sedimentů
přírodní artifíciální
listová hrabanka + křemitý písek spajkovaný artifíciální sediment
vyhodnocení efektů čistých látek
(1) spajkování artiflciálního sedimentu. (2) Po odpaření solventu je přidáno medium (3) ustavení rovnováhy mezi sedimentem a vodou, po 4 dnech přidáni šneci.
Médium
-    voda s přídavkem NaHC03, CaC03
-     16°C, 700±100|jS/cm
L:D 16:8 Komerční rasové pelety
Expozice, vyhodnocení
Parametry: mortalita a počet plně vyvinutých  a nezralých embryí
(Xeno)estrogenní účinek
ethinylestradiol, bisfenol A, octylfenol, nonylfenol Xenoandrogenní účinek
tributylcín, trifenylcín Biomonitoring dnových sedimentů (Nisa, Odra)
Testy toxicity s bezobratlými
Závěr
pro konkrétní případ, vzorek a problém může zkušený ekotoxikolog vybrat vhodnou kompozici detekčního systému
akutní   testy   toxicity  jsou jednou   z   několika součástí systému hodnocení
- chemické analýzy
- struktura zoocenoz a fytocenoz
- biokumulace a biokoncentrace -QSAR
- biomarkery
- atd...