Hodnocení toxicity směsí ■ Toxicita směsí kontaminantů není jednoduše predikovatelná z toxicity jednotlivých látek ■ Jediná spolehlivá cesta hodnocení toxicity směsí je testování založené na porozumění mechanismů působení jednotlivých složek směsi -predikce jejich působení ■ Toxicita směsí je velmi důležitá, neboť v prostředí jsou látky ve směsích Testování toxicity látek 1) Jednotlivé látky 2) Komplexní environmentálni směsi 3) Modelové směsi (definované složení) 4) Interakce látek ve směsi Testování jednotlivých látek ■ Známé koncentrace, vlastnosti, účinky ■ Snadné provedení ■ Snadné vyhodnocení ■ Interakce s dalšími látkami??? Komplexní environmentálni směsi ■ Mnoho látek v jedné směsi, také dosud neznámé a neprostudované látky ■ Různé mechanismy toxicity a různé účinky těchto látek ■ Neznámé interakce látek ve směsi Modelové směsi ■ Definované složení ■ Známé účinky a vlastnosti studovaných látek ■ Známé mechanismy toxicity ■ Vhodné ke studiu interakcí mezi jednotlivými látkami Působení látek ve směsích ■ Aditivita - Toxicita směsi toxikantu A a B je stejná jako suma toxicit toxikantu A a B působících samostatně ■ Antagonismus Toxicita směsi toxikantu A a B je nižší než suma toxicit toxikantu A a B působících samostatně ■ Synergismus - Toxicita směsi toxikantu A a B je vyšší než suma toxicit toxikantu A a B působících samostatně ■ Potenciace - Jedna chemikálie, která samostatně není toxická, zvyšuje toxicitu další chemikálie ve směsi 1.4 T 1.2 1 Synergismus 0.8 - 0.6 - 0.4 - 0.2 - 0 Aditivita Antagonismus 1TUA 1TUB 0.5TUA+ 0.5TUA+ 0.5TUA+ 0.5 TU B 0.5 TU B 0.5 TU B Testování xenoestrogenity modelových směsí ■ Nejčastěji testovány modelové směsi farmak, PAHs, PCBs ■ Látky působí stejným mechanismem (vazba na ER) ■ Predikce aditivních efektů směsí (CA) ■ Koncentračně-adiční model (CA) Koncentračně-adiční model (CA) ■ Předpokladem pro jeho použití je stejný mechanismus účinků jednotlivých látek ve směsi (např. vazba na receptor) ■ Principem této metody je možnost nahrazení jedné látky ve směsi druhou látkou ■ Každá jednotlivá látka tak přispívá k účinku směsi v poměru k její koncentraci, nikoli účinku! ■ Stejný princip je i základem pro výpočet TEQ při posuzování účinků environmentálních směsí Princip CA a TEQ Př. Směs E2 o koncentraci 4pM vykazující účinek 12% E2 max. + 6 xenoestrogenů vykazující účinek 0,1% E2 max. Každou ze 6 látek lze teoreticky nahradit koncentrací E2 způsobující stejný efekt 0,1 % (což je 1,1 pM E2) a přičíst tyto koncentrace ke 4,4 pM E2 a zjistit výsledný účinek směsi z křivky dávka-odpověď pro E2 (Obr.2). X (O E Ol LU 120 100 80 60 40 20 0 40%E2max. (11pM E2) predikovaný účinek směsi (CA) 0,5 0,1% E2max. (1,1 pM E2) 13% E2max. (4,4pM E2) 1 1,5 log c (pM) 2,5 Rovnice používané pro výpočet CA ucmku smesi ■ Pokud známe EC50, EC25 apod. jednotlivých látek, lze na základě této rovnice vypočítat predikovanou EC50 směsi ECmix = (p1/ECx1 + p2/ECx2 + ..........+ pn/ECxn) P = podíl složky jednotlivé látky v dané směsi ECmix = koncentrace směsi, která způsobí x% účinek ECxi = koncentrace samostatné látky, která způsobí x% účinek Rovnice používané pro výpočet CA ucínku smesi ■ Další rovnici lze použít pro případ srovnání s modelem součtu účinků, musíme ale znát sklon křivek u jednotlivých látek, tzv. slope faktor Emix=1/1+(1/((c1/EC501)P1 + (ci/ECöOi)^ +..+ (cn/EC50n)P3) Emix = účinek směsi (v % maxima) ci = koncentrace i-té látky v dané směsi EC50Í = EC 50 dané látky pi = slope faktor křivky dávka-odpověď u dané látky Další modely pro predikci účinků směsí ■ Model nezávislého působení (independent action, IA) -látky způsobují daný účinek nezávisle na sobě -jiným mechanismem Emix = 1 - n[1 - E(ci)] Emix - predikovaný efekt směsi o daném složení E(ci) - účinek vyvolaný koncentrací látky ve směsi pokud je aplikována samostatně, nesmí být vyšší než 1! ■ Model součtu účinků (ES, effect summation) -možno použít pouze v případě lineární odpovědi u křivek dávka-odpověď pro jednotlivé látky Model nezávislého působení Naměřené a predikované účinky směsi 16 biocidů působících různými mechanismy v testu toxicity u řas Zatímco model CA (čárkovaně) nadhodnocuje účinky směsi, model IA (plná čára) odpovídá naměřeným hodnotám 100 r -J—Ir 1 10 Total Concentration |pmoľl_| 100 Fig. 3. Observed and predicted algal toxicity of mixtures of ] 6 dissimilarly acting substances. (A) Mixture 1: components mixed in the ratio of their individual ECS) values. (B) Mixture 2: ľ om po ncn Ls mixed in the ratio of their individual EC] values. (•) experimentally observed toxicity; (O) controls; (■■■) prediction according to concentration addition; (—) prediction according to independent action. M. Faust et al. / Aquatic Toxicology 63 (2003) 43-63 Testování xenoestrogenity modelových směsí Příklad: Testování účinků 10 xenoestrogenních látek ve směsi (testy na kvasinkách) _ 1.0 £ 0.9 o J3 u 03 o.e 0.4 0.2 0.0 1 1 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 ES CA MIX Compound Již nízké neúčinné koncentrace jednotlivých látek mohou ve směsi způsobovat významný účinek! Zatímco podle predikce založené na koncentračně-adičním modelu (CA) jsou efekty aditivní, podle modelu součtu účinků (ES) by se jednalo o významný Synergismus!! Rajapakse et al./ Environ Health Perspect 110:917-921 (2002) Testování xenoestrogenity směsí Testy in vivo - měření vitelogeninu v rybách -potvrzení aditivního účinku podle modelu CA u střevle pro směs pěti xenoestrogenů Fathead innows Brian et al. (2005) EHP 113,721 100% c o ■■a o i s .C 50%. I 0% 1 10 mixture concentration 100 1000 Testování antiandrogenity ve směsích U některých antiandrogenních látek bylo zjištěno také koncentračně-adiční působení ve směsích Tyto testy byly prováděny in vivo - modelovým organismem byla koljuska tříostná a sleduje se pokles produkce spigginu u samic, indukovaný vnějšími androgeny (DHT) ^MH^H^M Koncentračně-adiční mechanismus pro směs 4 antiandrogenů in vivo Mixture of E1, E2, EE2 and NP stickleback (females), 21 d flow-through system 0.1 1 mixture concentration [ugrl] Aktivita dioxinového typu a modelové směsi PAHs ■ U aktivity dioxinového typu je často používán u environmentálních směsí koncept toxických ekvivalentů (TEQ), který určuje, kolikrát je látka toxičtější, než nejtoxičtější 2,3,7,8-TCDD ■ Platí ale pouze pro toxicitu zprostředkovanou aktivací AhR. Některé studie využívají tento koncept také při hodnocení aktivit modelových směsí dioxinově aktivních látek Aktivita dioxinového typu u modelových směsí PAHs ■ Pŕ. Binární a ternární směsi PAHs - naše studie ■ Potvrzení aditivních účinků na testech s kvasinkami i se savčími buňkami a to podle modelu koncentračně-adičního ■ Při srovnání s modelem ES (effect summation, součet účinků) je zjevné, že tento model většinou nadhodnocuje účinky modelových směsí Aktivita dioxinového typu u modelových směsí PAHs Kvasinkový model H4IIE.IUC 250 £200 1150 «.100 03 se 50 D naměřené hodnoty ■ koncentračně-adiční model D součet účinků 0.3nM rnin 3nM n 30nM 900nM 2700nM BaA+BaP+F 200 -, S 160 Co E Q 120 Q O >- 80 ii-o ^ 40 n D naměřené hodnoty ■ koncentračně-adiční model D součet účinků T T T T T T T T T T 3nM 30nM 150nM 300nM BaA+BaP+DBA 900nM Aktivita dioxinového typu u modelových směsí PAHs ■ Jiné studie ukazují i synergistické nebo antagonistické působení PAHs Alnafisi (2007) - ukazuje aditivní a synergistické působení směsí některých PAHs na kvasinkách Villeneuve (1998) - využívá EROD na rybích buňkách, některé směsi PAHs působily spíše synergisticky,některé antagonistický, používá koncept TEQ Shrnutí ■ Pro správnou predikci účinků modelových směsí látek je potřeba dobře znát mechanismus účinku jednotlivých látek i jejich fyzikálně-chemické vlastnosti ■ Pro látky působící stejným mechanismem účinku se jeví jako vhodný pro predikci aditivity koncentračně-adiční (CA) model ■ Pro látky působící odlišným mechanismem je vhodný spíše model nezávislého působení (IA) ■ Model součtu účinků (ES) - často nadhodnocuje, použitelný pouze v v úzkém lineárním rozmezí odpovědí pro jednotlivé látky