Hodnocení toxických vlastností: Vyhodnocení ekotoxikologických testů Hodnocení ekotoxikologických účinků Hodnocení vztahu dávka-odpověď: ke stanovení „predicted no effect concentration" (PNEC) = předpokládaná koncentrace nezpůsobující žádný účinek • Identifikace nebezpečnosti: identifikace škodlivých účinků • Hodnocení dat - Úplnost dat - Správnost dat • Spolehlivost: jak dobře je studie provedena, jak jsou interpretovány výsledky? Jsou aplikovány a dodrženy standardní metodiky? • Relevance: je použitý test vhodný? Jsou výsledné parametry stanoveny za relevantních podmínek? • Interpretace dat: nezbytné využití expertních znalostí • Např. pokud je trvání testu odlišné, sledované parametry různé (NOEC -EC50).... Faktory ovlivňující toxicitu Původ organismů Aklimatizace Abiotické faktory - Foto-indukovaná toxicita -pH - Tvrdost - Teplota - Obsah kyslíku - Organické látky Fyziologický stav Věk Pohlaví Hodnocení ekotoxikologických účinků ■ PNEC: PEC < PNEC: zajišťuje komplexní ochranu prostředí ■ Výpočet PNEC: násobení NOEC nebo EC50 přepočtovým faktorem (faktorem nejistoty) za využití statistických extrapolačních technik 1 PEC = predicted environmental concentration = očekávaná environmentálni koncentrace 1 Přepočtové faktory jsou používány k zohlednění nejistot Nejistoty: - intra- a inter-laboratorní variabilita v toxikologických datech - intra- a inter-druhové rozdíly (biologická variabilita) - extrapolace z krátkodobých na dlouhodobé testy - extrapolace z laboratorních dat na situaci v prostředí (synergistické, aditivní a antagonistické účinky...) Hodnocení ekotoxikologických účinků Akvatické prostředí: Základní data: akutní toxicita pro ryby akutní toxicita pro bezobratlé test inhibice růstu na řasách Assessment factors to derive a PNEC aquatic Assessment factor At least one short-term L(E)C50 from each of three trophic levels of the base-set (fish, Daphnia and algae) 1000 One long-term NOEC (either fish or Daphnia) 100 Two long-term NOECs from species representing two trophic levels (fish and/or Daphnia and/or algae) 50 Long-term NOECs from at least three species (normally fish, Daphnia and algae) representing three trophic levels 10 ( Field data or model ecosystems Reviewed on a case by case Species sensitivity distribution (SSD method) 5-1, to be fully justified on a casa by case basis Křivka dávka - odpověď: základní nástroj pro hodnocení toxických vlastností látek Křivky dávka-odpověďjsou založeny na normálním rozložení biologických proměnných lk-rm;il ■li.-.tr iL".ifi :ii -lsd (=0.16) l - Average response (=0.84) Characteristic (e.g. weight) Populační odpověď na toxické látky je zpravidla skloněná nalevo Less tolerant Intensity of stressor ^ More tolerant Koncept individuální tolerance: základ modelu vztahu dávky-odpovědi individuální účinná dávka (IED) -minimálni dávka vedoucí ke smrti jedince geneticky určená pro každého jedince - ^i cis ci? Experimentální design pro testy toxicity Log [X] Log [X] Testované koncentrace Kvalita výsledku je určena správnym výběrem testovaných koncentrací Testované koncentrace by měly pokrývat rozmezí od koncentrací nevykazujících žádný účinek až po 100 % letální koncentraci Dobře vybraná koncentrační řada má jednu koncentraci blízko EC50, a nejméně dvě koncentrace s částečným účinkem pod a nad EC50 - rozložených symetricky. Koncentrační řada by měla být v geometrickém měřítku. Ředící krok (koeficient) obvykle 2 až 10 Příklady koncentračních řad: - 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10000, 1:100000 látky s mírným sklonem odpovědi (některé pesticidy); koeficient ředění 10. - 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 ; příkřejší odpověď, koeficient 2. Pokud nemáme podkladová data- pro úsporu materiálu při hledání lineární části odpovědi -¥ doporučen dvoustupňový proces Krok 1 - Skríningový test Exponovat 5-10 organismů 10x koncentrační řadě po 24 - 96 h Cílem určit rozmezí kde se nachází 50 % letální koncentrace (LC50) # mrtvých žádný Končen. 103 žádný [X] mg/L někoak všichni všichni Q □ 30% 100% 100% Krok 2 - Definitivní test Z předchozích výsledků - stanovit rozmezí testu dolní = 10-2 = 0.01 mg/L horní = 10°= 1.0 mg/L Provést test s využitím logaritmického měřítka koncentrací, protože organismy zpravidla odpovídají logaritmicky na toxikanty Obvykle použít alespoň 5 koncentrací + kontrola - Kontrola - ověřuje toxicitu pozadí, ředící vody, media, zdravotní stav organismů, vliv stresu testovacího prostředí (testovací nádoby, osvětlení, teplota, atd.) - Validita testu!! např.úhyn >10% kontrolních organismů -^ neplatný test! Příklad uspořádání definitivního testu Pokus, zásah Ředění Koncentrace (mg/L) 1 10-2 0.01 2 10-1-5 0.032 3 10-1 0.1 4 -I 0-0.5 0.32 5 10° 1.0 Kontrola 0.0 Design testu toxicity Control / 6 mg/L m / Ľmgi. m / Kmgl. m / /so mťL^ /íoo meíLJ Exponováno 20 jedinců Odpověď po 24 hodinách, jedinců 0 0 1 6 13 17 Odpověď po 96 hodinách, jedinců 0 0 4 9 15 20 Výsledek testu Koncentrace Kontrola 6 mg/L 12 mg/L 25 mg/L 50 mg/L 100 mg/L Účinek 24 h 0% 0% 5% 30% 65% 85% Účinek 96 h 0% 0% 20% 35% 75% 100% Křivka dávka-odpověď Graf ukazující biologickou odpověď, např. enzymu, proteinu, populace či společenstva na rozmezí koncentrací polutantu Křivka mortality - obvykle zobrazována jako závislost kumulativní mortality na vzrůstající koncentraci Ideální křivka dávka - odpoved í é 80-1-I 40" ^—' f \ Lineární měřítko - těžko č telil -^ 0^ _____ í ____ \ ^^^^^ ^^^^^ J^__^^ 500 ^^^^000^ Koncentrace ) Ideální křivka dávka - odpověď NOEC Ne toxické ŕ^ U,l 1 LOEC ^ Letální účinky ------1 LC Odhad EC50 1000 10000 Logaritmické měřítko Křivka - sigmoidní tvar Vypočítané parametry EC 50 : účinná koncentrace způsobující 50% odpověď v testovací populaci. Účinná koncentrace, mg/L, ml/L Letální koncentrace LC50 Inhibiční koncentrace IC50 EC05, EC20, EC90, ... Rozmezí EC20 - EC80 Hodnocení ekotoxikologických účinků Sledované parametry testů toxicity krátkodobé studie: • LC50 (letální koncentrace) • EC50 (účinná koncentrace) dlouhodobé studie : • NOEC (no observed effect concentration) • LOEC (lowest observed effect concentration) • EC10 (10 % effects concentration) • ECx (x % effects concentration) • MATC (maximal acceptable toxicant concentration) geometrický průměr NOEC a LOEC, vypočítaný Parametry které mohou být odhadnuty z křivky dávka-odpověď • LD50 - odhadnutá dávka, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů • LC50 - odhadnutá koncentrace, která způsobí 50% mortalitu testovacích organismů • EC50 - odhadnutá koncentrace, která způsobí účinek (snížená reprodukce, růst atd.) u 50% testovacích organismů, či která způsobí 50 % maximálního účinku • IC50 - odhadnutá inhibiční koncentrace, která sníží normální odpověď o 50% • Další zahrnující jinou percentuální změnu (10%, 20%, atd.) Stanovované parametry NOEC: No Observed Effect Concentration. Nejvyšší testovaná koncentrace látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou LOEC: Lowest Observed Effect Concentration. Nejnižší testovaná koncentrace látky, která způsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou. Nejbližší vyšší koncentrace než NOEC. NOEL: No Observed Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila statisticky významný účinek v porovnání s kontrolou NOAEL: No Observed Adverse Effect Level. Nejvyšší testovaná dávka látky, která nezpůsobila negativní účinek. Je pozorován účinek, ale není považován za nebezpečný. Všechny testy toxicity se snaží určit hladinu toxikantu, která způsobí nebo nezpůsobí žádný účinek MATC • Maximum Allowable Toxicant Concentration • maximální povolitelná koncentrace toxikantu - geometrický průměr NOEC a LOEC - často nazývaná "chronická hodnota" Výběr koncentrací 90» I s^"^ ä^ 80» $ 70» O 60, Zadný toxick účinek Letální ú čim k C 40» .% 30» .g 20. O 10» ^*~~* ' Odhad EC50 ECO EC100 vzrůstající log koncentrací Stanovované parametry NOEC No Observed Effect Concentration = nejvyšší koncentrace, která ještě nevyvolává účinek statisticky významně odlišný od kontroly Odpověď populace v testovaných koncentracích je porovnávána s kontrolou Hledáme nejvyšší koncentraci, která nezpůsobuje toxickou odpověď Stanovení NOEC Příklad určení NOEC Porovnáváme 3 testované koncentrace s kontrolou Přežívající dafnie v kontrole 20 20 20 20 20 Přežívající .dafnie v koncentraci 5 mg/L 19 20 20 20 20 Přežívající dafnie v koncentraci 10 mg/L 19 20 20 19 19 Přežívající dafnie v koncentraci 20 m/L 18 19 19 19 19 Stanovení NOEC • Studentův t-test ANOVA (Analýza rozptylu) • Dunnettův test • Williamsův test • LSD test Studentův t-test Control 5 mg/L Average value 20 19,8 Variance 0 / 0,21 Difference t stát P(T==t) (1) /> 0,18695 t krit (1) ( 2,131346 P(T==t) (2) 0.373901 t krit (2) 2,776451 Control 10 mg/L Average value Variance 201 119,41 0 0,3 Difference 4 I I t stat 2.4494Ě P(T==t)(1) / 0,035242 \ t krit (1) [ 2,131846 ) P(T==t) (2) \ 0,070484 T- t krit (2) 2.//6451 Control 20 mg/L Str. hodnota 20 18,8 Rozptyl 0 0,2 Pozorovaní 5 5 Rozdfl 4 t stat ____6 P(T<=t)(1) / 0,001941 \ t krit (1) ( 2,131846 ) P(T<=t)(2) \ 0,003883 t krit (2) 2,776451 Výsledek analýzy rozptylu T T ^ * T * * O T T C 1 3 10 30 100 Koncentrace (mg/L) Nevýhody stanovených parametrů Jejich hodnota je silně závislá na designu experimentu a na: - Počtu opakovaní - Počtu testovaných koncentrací - Proceduře výběru koncentrací - Přirozené variabilitě systému - Použitých statistických metodách Křivka dávka - odpověď 0,1 1O0O 10000 Interval spolehlivosti EC50 Srovnání dvou toxikantů 100 90 SO 70 60 SO 40 30 20 10 O 0,1 100 1000 10000 Látka s odpovědí, kterou zobrazuje červená křivka je toxičtější než ta se žlutou křivkou Testy toxicity mohou být využity ke zhodnocení rozdílů v toxicitě dvou látek (pozor při interpretaci!) Figuře 1. ě i 50-* B^^^ i z) Do» Sklon křivky dávka - odpověď Důležitý pro odhad trendu toxicity. Toxikant s mírným sklonem může být nebezpečný na nízkých koncentracích i když EC50 je vysoká. 150-125-100-# 75-Š 50-S. 25-° 0--25--50- ■ dafnie . ryby rj£ j artemie 4 -3 -2 -1 Log koncentrace 0 Výpočet EC50 Interpolační metody - Dvou dávková metoda - Probitová analýza - Logitová analýza - Lineární regrese - Nelineární regrese Dvou dávková metoda logCEOO) = jc5( = *,+°^^(„) P2-P1 Nejjednodušší metoda odhadu Pokud je EC50 zhruba známá Jedna koncentrace v intervalu (20; 50) Druhá koncentrace v intervalu (50; 80) Interval (20; 80) je zhruba lineární pro účinek vs. Log. koncentrací Analýza výsledků testů toxicity Založeno na hypotéze že resistence k toxikantům je normálně rozložena Použít probitovou transformaci pro usnadnění analýzy Založeno na SD takže každý probit je spojen s procenty odpovědi Průměrná odpověď je definována jako probit = 5, všechny probity jsou pozitivní -> snazší vizualizace Je možno využít probitovou analýzu k výpočtu LC50 protože probitová transformace zlinearizuje (narovná) kumulativní distribuční křivku Probitová analýza Odpověď organismů na toxické látky = normální distribuce Není možné měřit přímo normální rozložení neboť účinek je kumulativní - zobrazení grafu kumulativní distribuce Normální rozložení Kumulativní distribuce Log Dávka Probitová analýza Lineární regrese: závislost účinku na log koncentraci loge Převedení křivky dávka-odpověď na přímku (lineární odpověď) Problematické hodnotit křivku Převedení křivky dávka-odpověď na přímku by hodnocení usnadnilo Kumulativní distribuce TLM) ' Transformováno na Probit - s * 1 Přímka (snadnější &*. analýza) Log Dávka Log Dose % probit % probit % probit % probit % probit % probit 0,2 2,122 10,0 3,718 30,0 4,476 50,0 5,000 70,0 5,524 90,0 6,282 0,4 2,348 11,0 3,773 31 0 4 504 51 0 5,025 71,0 5,553 91,0 6,341 0,6 2,488 12,0 3,825 32 0 4 532 52 0 5,050 72,0 5,583 92,0 6,405 0,8 2,591 13,0 3,874 33 0 4 560 53 0 5,075 73,0 5,613 93,0 6,476 1,0 2,574 14,0 3,920 34 0 4 588 54 0 5,100 74,0 5,643 94,0 6.5S5 1,2 2,743 15,0 3,964 35 0 4 615 55 0 5,126 75,0 5,674 95,0 6,645 1,4 2,803 16,0 4,006 36 0 4 642 56 0 5,151 76,0 5,706 95,5 6,695 1,6 2,856 17,0 4,046 37 0 4 668 57 0 5,176 77,0 5,739 96,0 6,751 1,8 2,903 18,0 4,085 38 0 4 695 58 0 5,202 78,0 5,772 96,5 6,812 2,0 2,946 19,0 4,122 39 0 4 722 59 0 5,228 79,0 5,806 97,0 6,881 2,5 3,040 20,0 4,158 40 0 4 747 60 0 5,253 80,0 5,842 97.5 6,966 3,0 3,123 21,0 4,194 41 0 4 772 61 0 5,278 81,0 5,878 98,0 7,054 3,5 3,188 22,0 4,228 42 0 4 798 62 0 5,305 82,0 5,915 98,2 7,096 4,0 3,249 23,0 4,261 43 0 4 824 63 0 5,332 83,0 5,954 98,4 7,144 4,5 3,305 24,0 4,294 44 0 4 849 64 0 5,358 84,0 5,994 98.6 7,197 5,0 3,355 25,0 4,326 45 0 4 874 65 0 5,385 85,0 6,036 98.8 7,257 6,0 3,445 26,0 4,357 46 0 4 900 66 0 5,412 86,0 6,080 99,0 7,326 7,0 3,524 27,0 4,387 47 0 4 925 67 0 5,440 87,0 6,126 99,2 7,409 8,0 3,595 28,0 4,417 48 0 4 950 68 0 5,468 88,0 6,175 99,4 7,512 9,0 3,659 29,0 4,447 49 0 4 975 69 0 5,496 89,0 6,227 99,6 7,652 99,8 7,878 Lineární regrese - probit vs. Log koncentrace 7 ■ /+ -w 6 ■ U Ph 4 ■ 3 ■ /^ EC50 0 0,5 1 1,5 2 2,5 log C Vztah mezi normálním rozložením a směrodatnými odchylkami Je složitější pracovat se směrodatnými odchylkami (34.13, 13.6, atd) převedení SMODCH na probity Příklad probitové analýzy Koncentrace (mg/L) Mortalita % Kontrola 0/10 0 0.3 0/10 0 1 0/10 0 3 1/10 10 10 4/10 40 30 9/10 90 100 10/10 100 Prohlédnout data -> zřejmé, že LC50 by měla být mezi 10 a 30 mg/L Graf -^ fit line by eye (cca stejný počet nad a pod křivkou) IED model -výsledkem log normální distribuce (sigmoidní křivka) 100 80 % Mortality / "sigmoid curve" 40 20 o - 0 50 100 150 200 250 Concentration Transformace dat: Krok 1 změnit osu "koncentrací" na logaritmické měřítko 100 /** 80 f 60 % Mortality f 40 r 20 - ^ a 10 f 100 10C 0 logarithmic scale Concentration Transformace dat: Krok 2 Převést % odpovědi na lineární formu - např. Drobit nebo logit 99.9 9 99 f 7 90 84 v 6 a % Mortal ity50 J 5 Probit "r w16 /* 10 --- J------ 4 3 1 Probit scale "d......| n 1 0 100 1000 Concentration Probit -1 sd mean +1 sd +2 sd log (concentration) Výsledné přímky nejsou příliš rozdílné nebo transformovaný log o g; o Logit Log koncentrace Parametry toxicity odvozeny z křivek dávka-odpověď NOEC "no observed effect concentration1' 95% confidence 100 1000 pncentration LOEC "lowest observed effect concentration" Využití probit- nebo logit-linearizované křivky dávka - odpověď 99.9 % Mortality50 .16 Probit scale 7 6 c Probit nebo logit 4 3 1000 Odhad LC/EC z přímky lineární regrese Y = a + bX • Y - transformovaný logit/probit, • X-logC, • b - sklon regresní přímky, • a - intercept regresní přímky vypočítat log(LC50) vypočítat LC50=10lo9(LC5°) Využití LC 50 1. Aplikační faktor - LC50 x n =___= povolená dávka - Dobrá pokud nemáme lepší informaci (chronické testy) 2. Zhodnocení rizika -> nižší LC50 = toxičtější 3. Vede k chronickému testování LC50 z akutního testu neposkytuje ekologicky relevantní výsledek -> potřeba testování na více ekosystémové úrovni Probit je kompromis mezi proveditelností, náklady a možností získat dostatečná data pro rozhodnutí o environmentálni toxicitě látky Modely vztahu čas-odpoveď Time Teorie zdravotní kondice ve vztahu k expozici toxickou látkou !..■'!■■:. 1 v pCtt. -.v s .1 Odpověď na stres: prahová, bezprahová a hormeze Prahová - žádná biologická odpověď při nízké dávce, pak se odpověď projeví se vzrůstající dávkou Bezprahová - bez biologické odpovědi pouze na nulové koncentraci Hormeze - počáteční biologická odpověď na toxikantje pozitivní, při vzrůstu koncentrace se stává negativní (příp. naopak?) Prahová odpověď i 1 B í: □ P Dose-Response Curve No-effect Range of / ronge increasing f effect with / -□ increasing / "5 dose / i J Maximum effect range Increasing Dose \ Bezprahová odpověď \ dose Hormeze Increasing concentration of alle ochernicals-------> Hormeze Vztah mezi expozicí kontaminantu a odpovědí organismu může být komplikovanější než se dříve věřilo Vysoké a nízké dávky kontaminantu mohou mít na organismus rozdílný vliv (hormeze neznamená, že účinky nízkých dávek jsou prospěšné, jenom to že jsou odlišné!!) Zapracování konceptu hormeze do ekotoxikologie a hodnocení ekologických rizik je v současnosti limitováno nedostatečnou znalostí mechanismu hormeze Teoretická křivka hormeze I i : (a) 1 —r - REFERENCE LEVEL - 5 > - Ť t ■ _^ cosEREaioMCf ^ -f COSE REGKÍN OF Y , , " Teoretická křivka hormeze i I _ ^ DOSE REGION OF APFAHENT ENHANCEMENT >- -< DOSE ^ECJON OF ACVE51SE EFFECTS >- - \ : J= - L--------------------- - J r - RErEFEMCE LSVB. ---- I | : a- (b) 1 T —j i ..... 40 60 Dose 80 1O0 Teoretická křivka hormeze III M ix im u m Sumuluion la\era£ľ5 l^O-ÜU'-i oícunlrol) ."■:■■::■ t r. lo NOAEL íavenEca 5-fold> Dosť ľ •■ j: ,^f\ .._........,m) , #$^W :- ■-■:: i« s™ I J« /x |n) Earzere [LH dilution] Calabrese and Baldwin (2003) Him-^n .vnphor^ií DNA Synthŕfis SodUnMscnil'j 1x10 5 M RÉtii-oc^a iWí Calabrese and Baldwin (2003) Regulační souvislosti Obecně používán prahový model pro ne-karcinoqenv, a lineární bezprahový model pro karcinogény (včetně radiace; EPA, FDA, a NRC). Přechod na model hormeze by pravděpodobně zmírnil některé limity pro polutanty ve vzduchu, vodě, potravinách a půdě. To by mohlo vést ke zmírnění nákladů na dodržování environmentálních limitů a na remediační projekty. Tato změna ale není moc pravděpodobná, i když s ukazuje, že mnoho toxikantů vykazuje prahové nebo hormezní působení v nízkých dávkách