EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2008 - RECETOX Test klíčivosti semen a inhibice růstu kořene hořčice bílé (Sinapis alba) Úvod Test byl vyvinut ke zjištění toxických vlastností odpadních vod a vodných výluhů odpadů na zástupci producentů ­ vyšších rostlin. Testuje se vliv vodného roztoku na klíčivost semen a růst kořenů kulturní plodiny hořčice bílé (Sinapis alba) v počátečním stadiu vývoje. Test spočívá v kultivaci semen v Petriho miskách na filtračním papíře nasyceném testovaným roztokem. Hodnotí se procento vyklíčených semen a nárůst kořene klíčních rostlinek v porovnání s kontrolou kultivovanou pouze v přítomnosti živného média. zpracováno dle Metodického pokynu MŽP ČR pro hodnocení toxicity odpadů a vodných výluhů (Vyhl. MŽP ČR 338/1997) Slovenské technické normy pro odpadové hospodářství STN 83 8303 OECD Guidline No.208: Terrestrial plants, growth test Metoda stanovení akutní toxicity pro Sinapis alba (BBrraassssiiccaacceeaaee)) A) vodných výluhů B) průmyslových odpadních vod Charakteristika organismu Hořčice bílá, Sinapis alba, patří do čeledi brukvovitých, Brassicaceae. Je to jednoletá, časně jarní rostlina ­ olejnina. Olej, kterého obsahuje semeno 24-32%, je využíván v potravinářském průmyslu i pro technické účely na výrobu mýdel, ve farmaceutickém a kosmetickém průmyslu. Patří zároveň mezi krmné plodiny. Hořčice má tenký vřetenovitý kořen, vzpřímenou lodyhu, roztroušeně chlupatou, až 150 cm vysokou s jasně zelenými listy. V dolní části jsou listy pravidelně lyrovitě peřenoklané až peřenodílné, v horní části trojklané. Květy jsou oboupohlavné čtyřčetné s chlupatými stopkami. Zpočátku jsou sestaveny v klubkaté květenství, později v protáhlé hrozny, kde jednotlivé květy kvetou odspoda. Plody jsou odstálé, bíle štětinaté šešule, s trojžilnými až pětižilnými chlopněmi a se smáčklým, mečovitě zahnutým zobanem, který je obvykle delší nežli samotná šešule. Semeno rostliny je na brukvovité rostliny poměrně velké, je žluté nebo bělavě žluté kulovitého tvaru. Dosahuje průměru 1,5 - 4 mm. Po vyklíčení vyrůstá jednoduchý kořen s hypokotylem. Později je kulovitý a bohatě rozvětvený. Rostlině se nejlépe daří na středně hlinitých nebo hlinitopísčitých půdách, dobře hnojených, s dostatkem vápníku a s neutrální až mírně alkalickou půdní reakcí ((KKooččíí,, RRaakkoovviicckkýý,, ŠŠvvaaggrr:: TTeessttyy sseemmiicchhrroonniicckkéé ttooxxiicciittyy ssee sseemmeennyy,, VVŠŠCCHHTT,, 22000011)).. Podmínky testu a použité chemikálie Testovací organismus: Sinapis alba Barva velikost klíčivost okrově žlutá (sytě žlutá) 1,5 ­ 2,5 mm minimálně 90% Sledovaná odezva: 1) klíčivost 2) inhibice růstu kořene ve srovnání s kontrolou EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2008 - RECETOX Podmínky testu: teplota objem testovaného roztoku velikost Petriho misky počet testovacích semen doba expozice počet paralelních stanovení osvětlení 20°C 2°C 5 ml v jedné Petriho misce 8 ­ 8,5 cm 5 na jedné Petriho misce 96 hodin (upraveno ze standardních 72 hod) 2-3 bez přístupu světla Chemikálie: testovaná látka, zřeďovací voda připravená podle ISO 7346 Pomůcky a zařízení: Petriho misky, filtrační papír hrubší pórovitosti, nůžky, pinzeta, pipety, odměrné baňky, milimetrové měřítko, termostat Zásobní roztok Chemikálie Koncentrace zásobního roztoku [gL-1 ] Č. 1 CaCl22H2O 11,76 Č. 2 MgSO47H2O 4,93 Č. 3 NaHCO3 2,59 Č. 4 KCl 0,23 Příprava kultivačního média: Na přípravu kultivačního média se použije 25ml každého zásobního roztoku: do odměrné baňky o objemu 1l se vlije malé množství destilované vody, následuje 25ml od každého zásobního roztoku a objem se doplní destilovanou vodou po rysku. Hodnota pH by se měla pohybovat v rozmezí 7,8 0,2. Případná úprava pH se provádí roztokem NaOH nebo HCl. Takto připravená zřeďovací voda se před použitím v testu nemusí dále upravovat. Možno přechovat v lednici při teplotě 6°C pro další experimenty. Testy akutní toxicity na standardu Vzhledem k možným změnám stavu semen a klíčivosti, je třeba ověřovat jejich kvalitu a podmínky testování pomocí testu toxicity na standardu K2Cr2O7 . Testy akutní toxicity se standardy se provádějí za stejných podmínek a vyhodnocují stejným způsobem jako základní testy. Rozpětí EC50, jež má kultura při době kultivace 72 hodin splňovat je uvedeno v tabulce. Test inhibice růstu kořene Sinapis alba na standardech Standard K2Cr2O7 (p.a.) Rozpětí hodnot EC50 [mgL-1 ] 10 ­ 50 Příprava vzorku Vzorek se připraví ředěním testovaného vzorku v určeném objemu kultivačním médiu. Postup testu * připravte kultivační médium dle návodu * vložte kruhové výseče z filtračního papíru do čistých Petriho misek (v duplikátech) * přípravte následující koncentrace dodaného testovaného vzorku: 0.25% v/v, 0.5% v/v, 1% v/v, 3% v/v (do 15 mL kultivačního média napipetujte potřebný objem testovaného vzorku ­ 37.5 l, 75 l, 150 l, 450 l / 15 mL - změnu celkového objemu zanedbejte) * připravené expoziční roztoky dávkujte do Petriho misek - vždy 5 mL / misku - u kontrol použijte 5 mL standardního média bez vzorku - použijte jednu pipetu a postupujte od nejnižší po nejvyšší koncentraci EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2008 - RECETOX * do každé misky vložte 5 semen hořčice bílé (vybraná semena dopředu namočena 20 min v destilované vodě) * Petriho misky překryjte potravinovou folií (zajistí cirkulaci vzduchu a omezí vypařování), důkladně popište a umístěte do temna do inkubační místnosti (pokojová teplota) * Po ukončení experimentu stanovte počet vyklíčených semen v kontrolách a v jednotlivých ředěních a u vyklíčených jedinců vyhodnoťte celkovou délku kořene. Získané výsledky lze využít pro výpočet hodnot IC50 (koncentrace zabraňující vyklíčení u 50% semen, resp. koncentrace 50% inhibující růst kořene) Vyhodnocení testu * Po ukončení expozice spočítejte počty nevyklíčených semen na jednotlivých miskách a zapište do tabulky (viz.protokol) * S využitím programu PROBIT vypočtěte IC50 pro inhibici klíčení a zapište spolu s intervaly spolehlivosti do tabulky * U vyklíčených semen vyhodnoťte délku kořene (s přesností na milimetry) a zapište do tabulky * Vypočítejte průměrnou hodnotu u každé varianty a hodnoty vyjádřete jako % kontroly a % inhibice (vyjádřete jako celá čísla) * S využitím programu PROBIT vypočtěte IC50 pro inhibici růstu kořene a zapište spolu s intervaly spolehlivosti do tabulky * Program PROBIT je možno stáhnout ze stránky US EPA: http://www.epa.gov/nerleerd/stat2.htm * Hodnoty IC50 pro inhibici klíčení a inhibici růstu kořene můžete rovněž určit lineární regresí: Vyneste získané inhibice v % do grafu v programu Microsoft Office Excel. Křivku proložte lineární regresní přímkou a dle rovnice regrese odečtěte z osy x koncentraci vzorku, ve které došlo k 50% inhibici růstu a klíčivosti.