Test inhibice růstu zelené řasy Raphidocelis subcapitata Úvod Tento růstový test je modifikací OECD 201 (ISO 8692) normovaného růstového testu. Odpověď organismu na danou koncentraci látky je hodnocena ve srovnání s průměrným růstem kontroly. Test byl optimalizován pro provedení v 96ti jamkových mikrotitračních destičkách. Exponovaným organismem je zelená řasa Raphidocelis subcapitata (Syn. Pseudokirchneriella subcapitata, Selenastrum subcapitata), která bude vystavena požadovaným koncentracím dvojchromanu draselného (K[2] Cr[2] O[7] ). Každá testovaná varianta bude provedena v 5 opakováních. Po zahájení a ukončení expozice je nutno změřit absorbanci (680 nm) pomocí spektrofotometru pro každou jamku a variantu. Vyhodnocení je provedeno na základě rozdílu absorbancí na konci testu a na začátku testu (KONEC-START). Materiál a reagencie - Řasová kultura kultivovaná ve standardním médiu ( 50% ZBB médium) o určité absorbanci - Mikrodestičky, automatické pipety, špičky k pipetám, nádoby pro vyředění odpovídajících koncentrací testované látky - Destilovaná voda, nesterilní 50% ZBB médium Průběh experimentu: · Příprava ředící řady: testovanou látku K[2] Cr[2] O[7] vyředíme ze zásobního roztoku o konc 200 mg/L na požadované koncentrace (100, 50, 25, 12.5, 6.25 mg/L) –5 mikrozkumavek - do první přeneste 400 uL zásobního roztoku a do 4 ostatních 200 uL destilované vody (vialky popište koncentracemi) z roztoku o nejvyšší koncentraci 200mg/L přeneste 200 uL do další vialky s vodou a důkladně promíchejte (výsledná koncentrace 100mg/L), stejným způsobem připravte seriovým ředěním další nižší koncentrace · Příprava inokula řas: řasové inokulum vyřeďujeme kultivačním médiem (50% ZBB) na požadovanou hodnotu b/ml a odpovídající objem. Výchozí množství buněk /ml řasového inokula pro založení experimentu je 4*10^5 (přibližně odpovídající optická hustota v rozmrzí 0,03-0,04 při 680 nm). Počty buněk na ml zjistíme pomocí počítání na Bürkerově komůrce. · Počítání na Bürkerově komůrce: Umístění krycího skla-viz obr.2.1,2.2. Krycí sklíčko by mělo být svorkami uchyceno dostatečně pevně (duhové okraje skla kolem svorek). Ke hraně uchyceného skla přiložíme pipetu obsahující 10 µl vzorku a lehce pouštíme-celá počítací plocha by měla být pokryta vzorkem. Samotné počítání probíhá ve čtverci o velikosti 12*12 malých čtverečků (dvojitá čára), nebo 3*3 velkých čtverců (trojité ohraničení) (obr.2.3-1). V našem případě budeme počítat 1 malý čtvereček v každém velkém čtverci (9)-zprůměrujeme a převedeme na plochu 1 velkého čtverce-vynásobením 16(počet malých čtverců)-dostaneme počet buněk v 0,1 µl-násobením 10 000 –dostaneme počet buněk a 1ml. (POZOR:počítají se pouze buňky uvnitř čtverce nebo hraničící napravo a nahoře (viz obr 2.3-3) Výpočet: (počet buněk (napočítáno)/ 9)*16* 10000)= výsledek počet buněk/ml · Doba expozice: 3 dny · Podmínky expozice: - teplota 23˚C - osvětlení 5080 lx (použití klasické halogenové zářivky a zářivky Aqua Glo fialová, 40W) Do jamky napipetujeme 225 µl suspenze řas o požadované absorbanci + 25 µl testované látky (do kontroly dáme 25 µl destilované vody). Testovaná látka je zředěna inokulem řas 1:9 (10x) na námi požadované koncentrace. Schéma mikrodestičky: +---------------------------------------------------------------------------+ | |1 |2 |3 |4 |5 |6 |7 |8 |9|10|11|12| |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |A |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |B |H [2]O |C1 |C2 |C3 |C4 |C5 |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |C |H [2]O |C1 |C2 |C3 |C4 |C5 |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |D |H [2]O |C1 |C2 |C3 |C4 |C5 |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |E |H [2]O |K |K |K |K |K |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |F |H [2]O |C1 |C2 |C3 |C4 |C5 |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |G |H [2]O |C1 |C2 |C3 |C4 |C5 |H [2]O|H [2]O| | | | | |--+-------+-------+-------+-------+-------+-------+------+------+-+--+--+--| |H |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O |H [2]O|H [2]O| | | | | +---------------------------------------------------------------------------+ H [2]O destilovaná voda C1 koncentrace dvojchromanu draselného 0.625 mg/L C2 koncentrace dvojchromanu draselného 1.25 mg/L C3 koncentrace dvojchromanu draselného 2.5 mg/L C4 koncentrace dvojchromanu draselného 5 mg/L C5 koncentrace dvojchromanu draselného 10 mg/L · Měření absorbance: Absorbanci měříme při vlnové délce 680 nm. Před každým měřením nutno jednotlivé jamky promíchat pipetou!!!! Získaný soubor (ve formátu MS-Excel) uložte na pevný disk počítače do adresáře "C:/biotesty-cviceni/ pod názvem START-vaše zkratka.xls, kde zkratka je musí být jasná a dobře rozpoznatelná všem osobám ve vaší pracovní skupině. · Mikrodestičku přikryjeme víčkem a exponujeme v inkubační místnosti s řízeným světelným režimem. Vyhodnocení inhibice · Po ukončení expozice spočítáme mikroskopicky (kontrolu a 2koncentrace dvojchromanu-kolem EC50-odhadneme okem) / změříme absorbanci jednotlivých jamek ve spektrofotometru při vlnové délce 680 nm. Získaný soubor opět uložíme podobně jako předchozí soubor (C:/biotesty-cviceni/ KONEC-zkratka.xls). · Hodnoty absorbance u kontroly zprůměrujeme a následně dosadíme veličiny dle vzorce: A[K] - A[v ]%I= ----------- * 100 A[K ]A[K] průměr absorbance kontroly A[v ] průměr absorbance jednotlivých variant koncentrací dvojchromanu draselného · Výpočet EC50: Vyneseme získanou inhibici v % do grafu v excelu. Inhibici, která se pohybuje kolem 50% vyneseme do samostatného grafu (má 2 hodnoty nad a pod 50% inhibicí), proložíme lineární regresní přímkou a dle rovnice regrese odečteme z osy x koncentraci dvojchromanu draselného, ve které došlo k 50% inhibici růstu. Protokol k růstovému biotestu se zelenou řasou R. subcapitata: Jména členů skupiny: Datum založení expozice: Datum hodnocení: -> délka expozice (počet dní): +--------------------------------------------------------------------------------------------+ | | | Koncentrace (mg/L) | | | | | | | | | |-------------------+-------------+----------------------------------------------------------| | |Kontrola (0) | 0.625 | 1.25 | 2.5 | 5 | 10 | | | | | | | | | | | | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |A680 START (průměr)| | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |SMODCH | | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |Počet buněk/ml | | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |A680 KONEC | | | | | | | | | | | | | | | |(průměr) | | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |SMODCH | | | | | | | |--------------------------------------------------------------------------------------------| |Počet buněk/ml | |--------------------------------------------------------------------------------------------| | | |--------------------------------------------------------------------------------------------| |% inhibice | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |-------------------+-------------+-------------+------------+-----------+---------+---------| |SMODCH | | | | | | | |-------------------+------------------------------------------------------------------------| |EC 50 (mg/L) | | | | | | | | +--------------------------------------------------------------------------------------------+ Graf: Závěr: