EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2008 - RECETOX
Akutní test s luminiscenční bakterií (Vibrio fischeri)
zpracováno podle ISO 14735 (2005)
Jedná se o rychlý, jednoduchý a levný test akutní toxicity na prokaryotickém organismu, který
slouží ke sledování toxických účinků nejen čistých chemických látek či jejich roztoků, ale i
environmentálních směsí extrahovaných z různých vzorků. Tato metoda je méně vhodná pro silně
zabarvené vzorky nebo vzorky obsahující nerozpuštěné látky nebo látky, které reagují s živným
roztokem nebo podléhají změnám během zkoušky (například vysrážení, biochemickému nebo
fotochemickému rozkladu), a tím mohou poskytovat nesprávné výsledky, popřípadě zhoršit
reprodukovatelnost
Princip
Testovacím organismem v testu je bakterii Vibrio fischeri, která za optimálních podmínek
intenzivně luminuje (světélkuje). Test je založen na zhášení bioluminiscence této bakterie je-li ve
vzorku přítomna biodostupná toxická látka, která může metabolickou aktivitu bakterií významně
snížit, případně zastavit. To se ihned projeví poklesem intenzity luminiscence (bioluminiscence).
Množství emitovaného světla se měří luminometrem před a po přidání testované látky (po 15 a 30
minutách expozice). Teplota v průběhu testu musí být konstantní (t = 15°C).
Přístroje
Cirkulační termostat s možností temperace na 15°C, luminometr
Chemikálie a spotřební materiál
automatické pipety 5 ­ 50 l, 50 ­ 200 l, 200 ­ 1000 l, 1000 ­ 5000 l, špičky, NaCl, Síran
zinečnatý (ZnSO4.7H2O), 3,5-Dichlorfenol, Dichroman draselný (K2Cr2O7)
Podmínky testu:
* teplota: 15C
* délka expozice 30 min.
Příprava vzorku
Testované látky naředíme v požadovaných koncentracích ve zkumavkách, jako standardní
rozpouštědlo se používá 2% NaCl (chlorid sodný). Environmentální vzorky se zkoušejí co nejdříve
po odběru či přípravě. Vzorek se důkladně protřepe a je-li to nutné, homogenizuje. Vzorek by měl
být upraven na pH 7,4  0,3
Postup testu
* K zamražené kultuře bakterie ihned po otevření přidáme 0,5 ml 2% NaCl a necháme
v ledové lázni.
* Po 15 minutách rehydratace přidáme 80 l do 2,5 ml vychlazeného 2% NaCl a necháme 15
minut vytemperovat.
* Zředěná suspenze bakterií se pipetuje do 12 zkumavek po 200 l.
* Po dalších 15 minutách ekvilibrace se měří počáteční intenzita světla synchronizovaně po 30
sekundách. Po každém měření se přidává 800 l 2% NaCl (negativní kontrola) respektive
měřeného vzorku.
* Další měření se provádí po 15 a 30 minutách.
EKOTOXIKOLOGICKÉ BIOTESTY 2008 - RECETOX
Výpočty
Nejdříve vypočítáme koeficienty přirozeného vyhasínání bioluminiscence pro jednotlivé časy:
R(t) = IK (t) / IK (0)
kde R(t) je koeficient přirozeného vyhasínání v čase t, IK (t) je intenzita bioluminiscence u
kontroly v čase t a IK (0) je intenzita bioluminiscence u kontroly v čase 0.
Ke kvantitativnímu vyhodnocení se vypočte % úbytek světla (inhibici luminiscence):
Inh % = [R(t) . I (0)- I (t)] / [R(t) . I (0)] . 100
kde, R(t) je koeficient přirozeného vyhasínání v čase t, I (0) je bioluminiscence v čase 0,
kdyby neobsahoval toxikant a I (t) je naměřená bioluminiscence v čase t.
Ověření citlivosti
Zkouška se považuje za platnou pokud jsou splněny následující podmínky:
* Koeficient přirozeného vyhasínání R(t) se pohybuje v rozmezí 0,6-1,8
* Referenční roztoky (všechny tři pro zasobní kulturu nebo pouze dichroman draselný pro
každý test) způsobují 20-80% inhibici po 30 minutách pro následující koncentrace
standardních látek:
3,4mg/l 3,5-Dichlorphenol
2,2 mg/l Zn (II) 9,67 mg/l ZnSO4.7H2O
18,7 mg/l Cr (VI) 52,9 mg/l K2Cr2O7