Haploidní techniky androgeneze gynogeneze Význam haploidních rostlin * detekce recesivních alel (v haploidním stavu nejsou překryty dominantní alelou) * zdvojený haploid poskytuje homozygotní linie * materiál může být použit pro somatickou hybridizaci (fůze protoplastů) ­ není tak indukována polyploidie Terminologie * haploid = rostlina s gametickým počtem chromozómů monohaploid n = x dihaploid n = 2x (haploid tetraploidních druhů) * zdvojený haploid = doubled haploid plant (D.H. plant) Zdvojení počtu chromosomů působením kolchicinu 2 monoploidní buňky 1 diploidní buňka Haploidní kultury androgeneze = regenerace haploidních rostlin ze samčího gametofytu kultury nezralých prašníků nebo izolovaných mikrospor gynogeneze = regenerace haploidních rostlin ze samičího gametofytu kultury neoplodněných vajíček Prašníkové kultury tabáku Nicotiana tabacum L. Foto: J. Dubová 1. Androgeneze Tvorba haploidních regenerantů ze samčího gametofytu Vznik haploidů u vyšších rostlin * SPONTÁNNÍ frekvence 10-3 - 10-6 ­ haploidní partenogeneze gynogeneze androgeneze * EXPERIMENTÁLNÍ = INDUKOVANÁ ­ klasické způsoby ­ explantátové metody Vznik haploidů u vyšších rostlin * Klasické způsoby ­ působení fyzikálních faktorů (UV, X, teplotní šoky) ­ působení chemických faktorů (kolchicin, maleinhydrazid) ­ zásahy do procesu opylení a oplození * kastrace a izolace * opožděné opylování * opylení inaktivovaným pylem * vzdálená hybridizace - eliminace chromozómů Historie haploidních kultur 1964 Guha a Maheshwari - kultivace nezralých prašníků a regenerace homozygotních rostlin durmanu Datura innoxia Mill. 1967 Bourghin a Nitsch - kultivace haploidních buněk (mikrospor) a regenerace homozygotních rostlin tabáku Nicotiana tabacum 1996 Keller a Korzun - gynogeneze řepy Beta vulgaris L., Allium cepa L., Gerbera jamesonii H. Bolus ex Hook 2000 šlechtitelské programy polních plodin (obiloviny, řepka) využívají haploidní kultury in vitro Vznik haploidů u vyšších rostlin * Explantátové metody * prašníkové kultury * mikrosporové a pylové kultury * kultivace semeníků * chromozomální redukce v kalusových, buněčných nebo protoplastových kulturách Bulbosum Method of Haploid Production Hordeum vulgare Barley 2n = 2X = 14 Hordeum bulbosum Wild relative 2n = 2X = 14 Haploid Barley 2n = X = 7 H. bulbosum chromosomes eliminated X Embryo Rescue Ťhis was once more efficient than microspore culture in creating haploid barley Ňow, with an improved culture media (sucrose replaced by maltose), microspore culture is much more efficient (~2000 plants per 100 anthers) aggie-horticulture.tamu.edu/faculty/ king/Tissue%20Culture%20Lecture.pptaggie-horticulture.tamu.edu/faculty/ king/Tissue%20Culture%20Lecture.ppt 1. 2. 3. Produkce haploidů a dihaploidů ječmene 1. mezidruhová hybridizace H. vulgare a H. bulbosum = hybridní zygota 3. eliminace chromozómů H. bulbosum = haploidní rostlinka 2. izolace hybridního embrya 4. zdvojení chromozómů působením kolchicinu = diploidizovaný haploid Faktory ovlivňující pylovou embryogenezi zahrnují vnitřní fyziologický stav výchozí rostliny a její genetické zvláštnosti - druhová specificita * druh rostliny, genotyp * fyziologický stav výchozí rostliny (ontogenetické stáří, fotoperioda, výživa, použití herbicidů) * stadium vývoje pylu * předpůsobení na poupata a izolované prašníky (snížená teplota, centrifugace) * předpůsobení izolovaných mikrospor nebo pylu (centrifugace, hladovění, kolchicin) * kultivační podmínky * aktivní uhlí * železo Mateřská rostlina optimální fyziologický stav mateřské rostliny je pro prašníkové kultury velmi důležitý ontogenetické stáří - prašníky by se měly odebírat z poupat ze začátku období kvetení výživa, dostupnost vody teplota - u některých druhů se výnos haploidních embryí zvyšuje při předpěstování mateřských rostlin při nízké teplotě (5°C) fotoperioda - vyšší výnosy haploidních embryí byly získány při pěstování donorových rostlin při krátkém dni a vysoké světelné intenzitě Scanning electron micrograph of an early floral developmental stage of the outcrossing subspecies of Clarkia xantania (Onagraceae). Sepals, which are covered by trichomes, have been partially removed and floral organs have been falsely colored: style and stigma, yellow; large anthers, blue; small anthers, purple; petals, red. Photo: C. J. Runions Annals of Botany Clarkia xantania (Onagraceae) prašník prašnéprašné pouzdropouzdro tetrádytetrády mikrospormikrospor tapetumtapetum exotheciumexothecium endotheciumendothecium mezofylmezofyl konektivkonektiv nitkanitka prašný váčekprašný váček stomiumstomium Řez prašníkem lilieŘez prašníkem lilie nezralá stěna Vakuola Meióza I a II Kalóza 1. mitóza jádro veget. buňky jádro generat. buňky odvodnění pylová mateřská buňka tetráda mikrospor volné mikrospory mikrospora nezralé pylové zrno zralé pylové zrno (dvoubuněčný pyl) klíčící pylové zrno pylová mitóza migrace jádra apertura dozrávání pylu tvorba mikrospor:tvorba mikrospor: mikrosporogenezemikrosporogeneze tvorba gamet:tvorba gamet: mikrogametogenezemikrogametogeneze jádro spermatické buňky pylová láčka vývojová stadia vhodná pro iniciaci androgeneze Homologous chromosomes continue to condense into their most compact forms as they are near diakinesis. Late-prophase I. IASPR Lilium http://images.iasprr.org/lily/male.shtml Metaphase I. This view shows metaphase chromosome assemblages both in longitudinal view and in polar view (end-on). IASPR Lilium A distinct layer of cell wall is laid down between the two phases of meiosis in lily. The phases in the second half of meiosis occur rapidly. Telophase I. IASPR Lilium The chromosomes undergo a separation of chromatids during the second half of meiosis in a cycle similar to mitosis Metaphase II. IASPR Lilium Telophase II. Cytokinesis between the members of the tetrads is completed. Separation of the cells from the microsporocyte wall occurs soon after. IASPR Lilium As microspores complete this stage, they elongate somewhat, becoming a bit football shaped Tetrads completing the callose stage IASPR Lilium Released microspores At this stage, microspores have an exine (outer wall of sporopollenin) but are still filling with storage materials and remain pliable for a short time. IASPR Lilium Bicellular pollen Generative cells are first formed in contact with the intine (inner pollen wall), but the cells then become immersed in the cytoplasm - truly becoming "a cell within a cell". IASPR Lilium Nicotiana tabacum L. metafáze I.dělení tetrády počátek tvorby tetrád mikrospora se zbytky kalózy Typy androgeneze přímá androgeneze = vývoj globulárního embrya a následně haploidní rostliny přímo z pylového zrna nebo mikrospory nepřímá androgeneze = z pylového zrna nebo mikrospory se vyvine napřed haploidní kalus v něm indukce organogeneze regenerace haploidní rostliny přímá androgeneze na prašníku tabáku Nicotiana tabacum L. Foto: J. Dubová Typy regenerace v prašníkových a mikrosporových kulturách produkce haploidních rostlinek indukcí embryogeneze opakovaným dělením mikrospory nebo mladého pylového zrna 1. přímá androgeneze 2. nepřímá androgeneze získání haploidního kalusu a z něj regenerace haploidních rostlin obnovení diploidního stavu působením kolchicinu fertilní homozygoti přímá androgeneze nepřímá androgeneze Předpůsobení stres nízkou nebo vysokou teplotou 2-30 dny při teplotách 3-10°C (Nicotiana, Datura, Brassica) nebo 35°C (Capsicum) může stimulovat embryogenesi máčení oddělených květenství ve vodě po několik dnů = stres hypoxický centrifugace prašníků aplikace vakua změny uspořádání mikrotubulů aplikace kolchicinu hladovění změna polohy jádra Androgeneze u tabáku prašník s embryoidy řez embryoidy 7 dní http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm Androgeneze u tabáku prašník s embryoidy řez embryoidy http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm 14 dní Androgeneze u tabáku prašník s embryoidy řez embryoidy http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm 21 dní Prašník tabáku s vyvíjejícími se haploidními rostlinkami, vzniklými z mikrospor Androgeneze u tabáku http://users.ugent.be/~pdebergh/gam/gam2dp2.htm později Prašníkové kultury a regeneranti transgenní tabák ­ se Zmp60.1+MTX 2-T3-3 2-T4-2 kvetoucí, ale sterilní haploidní rostlina ˇ v prašníkových kulturách často nedochází k indukci dělení mikrospor vlivem inhibičních látek z prašníku nebo nedostatečným kontaktem s živinami * u prašníkových kultur se může vyskytnout rychlá proliferace diploidního pletiva stěny prašníku, nežádoucím výsledkem je pak heterozygotní diploid * výsledkem mikrosporové kultury je vždy homogenní populace homozygotních rostlin * u mikrosporových kultur je větší nebezpečí infekce Výhody mikrosporových kultur oproti kulturám prašníkovým nejdůležitějším faktorem pro získání haploidů je určité vhodné vývojové stadium v době odběru materiálu do kultury. u některých krytosemenných rostlin mohou být selektována poupata, která obsahují prašníky v různých vývojových stadiích. pyl může být frakcionován centrifugací na percollovém gradientu. u druhů s určitým počtem prašníků ve květu je nutno testovat celou sérii pupenů, aby byla zřejmá vývojová stadia. Některé snadno rozlišitelné znaky se potom používají pro charakteristiku žádaného vhodného stadia (délka poupěte, poměr délek květních obalů: např. u tabáku koruna je jen o něco málo delší než kališní ušty; stadium 2). Vývojová stadia Vývojová stadia poupat tabáku Nicotiana tabacum L. 1 2 3 4 5 6 Suspenze embryí z mikrospor Brassica napus R. Wellens ­ in: katalog Duchefa 1996 2. Gynogeneze Tvorba haploidních regenerantů ze samičího gametofytu ˇ tvorba haploidních rostlin z neoplozené vaječné buňky (samičí partenogeneze) * embryo tak obsahuje pouze mateřské chromosomy, protože nedošlo k fůzi spermatické buňky s buňkou vaječnou * indukce gynogeneze in vitro = kultivace vajíček nebo semeníků Gynogeneze Poznámka na závěr * Žádná z metod pro získání haploidů není univerzální pro všechny druhy. * Všechny dosud užívané cesty k haploidii je možné využít (indukovat) pouze v omezeném = krátkém vývojovém stadiu života rostliny.