Kryoprezervace a uchovaní genetických zdroju definice metody použiti Uchovaní genetických zdroju Ztráta genetických zdroju je nenahraditelná. původní rostlinné druhy - výskyt v přirozených ekosystémech - jejich ohrožení je určeno podle míry ohrožení těchto ekosystému. • vyšlechtěné kultivary - udržovací šlechtění je pracné a nákladné Uchovaní genetických zdroju Uchování semen = nejběžnější a nejstarší metoda Vegetativní orgány - hlízy, kořeny, cibule, řízky Uchovaní genetických zdroju: A. semena Uchování semen klasicky = při normální teplotě (max. 1 - 5 let) Semenné banky = uchování semen na delší dobu ( při - 20°C) ortodoxní semena - přežívají sr\\zer\\ obsahu vody na 5-10% rekalcitrantní semena - dehydratace nesmí klesnout pod limit 12 -30% skladovat pod 0°C, tropické druhy pod 10°C (kávovník, kakaovník, kokosová palma, kaučukovník, z našich: dub, buk, jírovec, kastanovník) Uchovaní genetických zdroju: ' B. vegetativní orgány uchovávam vegetativních organu (hlízy, kořeny, cibule, řízky) rizika choroby (houbové, virózy) škůdci nepříznivé podmínky (teplota, vlhkost...) pracné a nákladné (prostory, manipulace) Genové banky in vitro uchování aktivně rostoucích kultur uchovaní kultur v minimálním růstu kryoprezervace Uchovaní aktivně rostoucích kultur - pracné - pasáže: dny, týdny, měsíc - nákladné (energie, prostory) - nebezpečí infekce - nebezpečí somaklonální variability »ředstavují paralelu ke klasické polní bance hledaly se podmínky pro prodloužení subkultivačního intervalu chovaní kultur v minimálním růstu metody založené na kultivaci při sriižené teplotě rostliny z mírného pásma: 20 - 25°C 4 - 10°C rostliny z tropu: 25 - 30°C 15 -20°C metody založené na modifikaci složení kultivačního média - sr\\žer\\ koncentrace solí (MS 1/2 - MS 1/4), přídavek osmotíka - 3% manitol, 5% sacharóza, ABA metody založené na modifikaci plynného složení atmosféry v kultivačních nádobách Uchovaní kultur v minimálním růstu Výhody: možnost vizuální kontroly testování na patogeny - možnost mezinárodní výměny menší nároky na prostor (2m2 x 1 ha) Problémy: stres muže mít vliv na regenerační schopnost muže být ovlivněna genetická stabilita - nutnost kontrol (kritéria morfologická, cytologická, biochemická molekulárně-biologická=ĎNA) Solanum, Medicago, Fragaria, Prunus, Malus, Beta • uchovaní materiálu při nízkých teplotách, nejčastěji v tekutém dusíku (-196°C) (P. Ďebergh) • neletalm skladovaní pletív nebo tkaní při ultra nízkých teplotách (E. E. Benson) Cíl kryoprezervace uchování rostlinného materiálu po delší dobu za účelem minimalizace růstu a vývoje in vitro uchování životaschopnosti a genetické stability zachování plného vývojového a funkčního potenciálu setrem pracnosti tvorba ledu ■ extracelulární - začína dříve intracelulární (nukleace) - velké ledové krystaly poškozují struktury organel = snaha o zmenšení velikosti krystalu ledu vlivy poškození různými roztoky Přístupy ke kryoprezervaci tradiční = aplikace chemických kryoprotektiv a kontrolované, pomalé zmrazovaní 0,5- 1°C/ min (vyžaduje speciální přístroje) novější = rychlé zmrazovaní vitrifikace enkapsulace/dehydratace (relativně dostupnější) Možnosti kryoprotekce rostlinného materiálu • penetrující - ovlivňují biochemické a strukturální vlastnosti membrán a tak zvyšují toleranci k mrazu (ĎMSO, glycerol, prolin) nepenetrující - mají vliv většinou jako osmoticky dehydratační (sacharóza, manitol, sorbitol) Pomalé kontrolované zmrazovaní aplikace chemických kryoprotektiv bod postupné kontrolované ochlazování pod Dod mrazu (-30 až -60°C), pak vložení do tekutého dusíku - pomalé ochlazování zvyšuje dehydrataci buněk, což snižuje bod mrznutí po zkoncentrování buněčných roztoku pomalým ochlazováním muže být zbývající voda vitrif ikována rychlým zmrazením • zpětné rozmrazování má být co nejrychlejší rotocol: For succesful cryopreservation the material must be cooled slowly to ca -30 to -60°C,before transfer to liquid nitrogen. This slow cooling gives rise to cellular dehydratation which progressively concentrates the cellular constituents and depresses their freezing point. Once cell solutions have been concentrated by slow cooling, remaining water can be vitrified by freezing the plant material as rapidly as possible. In some cases small plant material can be transferred immediately to minus 196°C without damaging the plant tissue. Thawing usually is most succesful when it happens rapidly. kryozkumavka Ukladaní vzorku do tekutého N Pristroj KryolO pro klasickou kryoprezervaci kontrolované pomalé zmrazovaní v kryozkumavkách Průběh zmrazovaní vzorku kalusu t/min/ T/°C/ netěsnosti ventilu při napouštění 30 £E 50 60 _>. .._____________>■ _____■■■■> V ...... t 7 ^~ teplota uvnitř ampule ^^ teplota uvnitř chlazeného prostoru ampule do N; Vitrifikace proces velmi rychlého zmrazení, při kterém je zabráněno tvorbě ledových krystalu, protože vodný roztok je příliš koncentrovaný - zabránění nukleace ledových krystalu voda tuhne do tzv. sklovitého amorfního tvaru negativně muže působit na životaschopnost materiálu vysoká koncentrace kryoprotektiv, která je nutná pro navození vitrifikace = nestabilní stav - muže vést k tvorbě krystalu při zahřívání Postup: „Enkapsulace / dehydratace" kultura prýtu otužení materiálu - zvýšená osmotická hodnota ________média, snížená teplota kultivace______ izolace meristému enkapsulace: přenos do 3% alginátu nasátí alginátu s meristemem do špičky pipety nakapání alginátu do 0,1 M roztoku CaC\2 _________polymerace alginátu 30 min._________ dehydratace: osmotická (0,75M sacharóza) 1-5 dní osušení ve sterilním vzduchu f low-boxu 1-4 hod přenos vysušených kuliček do kryozkumavky rychlé zmražení - vhození do N2 V Alqiri Alginótové perly s vyrostajícími prýty brambor (Solanum tuberosum) z enkapsulovaných meristémů Příklady využiti kryoprezervace meristému Německá sbírka mikroorganismu a buněčných kultur (ĎSMZ, Braunschweig, Německo) - meristémy 519 starých kultivaru brambor - metoda mrazení perel International Potato Centre (CIP, Lima, Peru) - 345 kultivaru brambor - vitrifikace K.U. Leuven, Belgie - 306 kultivaru banánu (1/4 ze světového počtu kultivaru) - vitrif ikace kasava, česnek, máta a australské ohrožené druhy http: //scieng. abertay. ac. uk/plant/genebanking. htm http: //www. ars. usda. gov/Main/docs. htm?doc id=8100 http://www.ars-grin.gov/ncgrp/volk_lab.htm