Transgenní rostliny Biotechnologie úvod metody Biotechnologie - přístup k přírodě biotechnologie = metoda využívající ve prospěch člověka různé organismy a současně pozměňuje jejich vlastnosti tak, aby byly co nejlépe využitelné kvašení - snahy konzervovat rychle se kazící potraviny a krmiva kvašení mléka ­ sýry, kefír, kumys, jogurty víno, pivo - bible, Egypt boza - kvašené proso (Balkán, Orient) saké - japonský nápoj z kvašené rýže pombe - africký nápoj z kvašeného tropického ovoce kvašené zelí siláže výroba enzymů - praní, příprava ovocných šťáv, výroba škrobu... farmaceutický průmysl bioremediace - biologické čištění vody, odstraňování ropných produktů z půdy... Cíle moderních biotechnologií zvýšení výnosů plodin, produkce dobytka i ryb zvýšení nutriční hodnoty, snížení ztrát produkce zlepšení chuti, kvality a trvanlivosti potravin omezení používání pesticidů a chemických látek (hnojiva, postřiky) získání organismů přežívající za stresových podmínek získání obnovitelných a ekologických zdrojů pro výrobu produkování léčiv ekonomicky a bezpečně + vakcíny vyvinutí nových způsobů čištění vod a půd příprava enzymů nových vlastností - snížení energetické náročnosti výroby a ekologických rizik Definice podle protokolu o biodiverzitě LMO = living modified organism organismus se změněnou genetickou informací, kterou je schopen předávat do další generace (polyploidizace, konjugace, transdukce) GMO = genetically modified organism získaný zavedením cizorodé DNA (metody rekombinantní DNA) genové nebo genetické inženýrství ,,Klasické" a ,,moderní" biotechnologie klasické šlechtění LMO přirozené mutace a jejich křížení indukované mutace ozařování UV nebo ionizující záření chemomutageneze vysoké výtěžky antibiotik, produkce enzymů, sladovnický ječmen Nevýhoda - metody jsou ,,slepé" = vyvolává se poškození a následně se čeká, zda náhodou nevznikne výhodná změna. Navíc nevíme, kolik genů se změnilo a jak. Příklady kultivarů produkovaných mutačním šlechtěním Plodina Kultivar Metoda indukce mutace rýže Calrose 76 gama záření pšenice Above azid sodný Lewis neutrony oves Alamo-X X-paprsky grapefruit Rio Red neutrony Star Ruby neutrony Cynodon dactylon troskut prstnatý Tifeagle gama záření Tifgreen II gama záření Tift 94 gama záření Tifway II gama záření salát Ice Cube ethyl methan sulfonát (EMS) Mini-Green ethyl methan sulfonát Phaseolus vulgaris fazol obecný Seafarer X-paprsky Seaway X-paprsky šeřík Prairie Petite neutrony ,,Klasické" a ,,moderní" biotechnologie moderní biotechnologie - umožňují cílený postup = vnášení pouze žádaného genu beze změny ostatních genů GMO je možný přesun vlastností mezi organismy, které se jinak nemohou ani potkat mohou ale existovat i nechtěné následky požadavek regulace a správného zacházení Danaus plexippus, danao stěhovavý ,,Monarch" imago a housenka http://www.kidzone.ws/animals/monarch_butterfly.htm Charakteristika rostlinných genů gen kódující sekvence (+ repetitivní DNA) regulační část kódující úseky = exony nekódující úseky = introny promotor zaváděcí sekvence terminační sekvence Promotor sekvence DNA - schopnost vázat RNA-polymerázu = zahajovat přepis genu TATA box počátek transkripce enhancery /rozpoznávací elementy sekvence promotoru se netranskribuje, ale rozhoduje o tom kdy, kde a s jakou intenzitou se bude gen transkribovat Ondřej 1992 Zaváděcí sekvence počáteční úsek mRNA, na níž se uchycují ribosomy a postupují ,,naprázdno" až k prvnímu iniciačnímu kodonu rozhoduje o stupni afinity ribosomů, tedy o intenzitě translace Počátek translace první triplet ATG, rozhoduje o účinnosti translace Exony a introny počátek a konec intronu GT-AC Polyadenylační a terminační signál AATAAA Ondřej 1992 Obecné schéma transformace příprava rekombinantní DNA (konstrukt) vnesení DNA do rostlinné buňky test exprese vnesených genů demonstrace stabilní integrace DNA do rostlinného genomu Metody transformace (vnášení DNA) přímé nepřímé - pomocí vektorů lipozómy uzavírající DNA elektroporace mikroinjekce DNA do jádra bombardování mikroprojektily vakuová infiltrace Agrobacterium (plazmidy) rostlinné viry modifikovaný bakteriofág plazmidy intermediární binární Transformace pomocí liposomů liposom + DNA protoplast 1. 2. Elektroporace vyžaduje použití protoplastů (bakterií, kvasinek) DNA proniká do buněk po vytvoření dočasných mikropórů v plasmatické membráně vlivem působení el. pulsů Mikroinjekce DNA do jádra protoplastu pipeta držící protoplast protoplast špička mikropipety s DNA Princip biolistické metody krystal wolframu obalený DNA bombardování pletiva regenerace transgenních prýtů na selekčním médiu Zařízení pro biolistické metody Biolistická metoda: pro transformace pletiv trav ­ GUS marker exprese aktivity enzymu glukuronidázy po bombardování kalusu Brachypodium partikule Au 0,5 mm využití kalusové kultury pro transformace jednoděložné rostliny jsou resistentní vůči infekci Agrobacterium http://www.aber.ac.uk/plantpathol/brachytransform.htm Nádor ,,Crown gall" vytvořený po infekci Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens Vektory: Agrobacterium tumefaciens, Agrobacterium rhizogenes Půdní bakterie: Pseudomonas, Corynebacterium Agrobacterium, Rhizobium Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes nádory kořínky Ti plasmid Ri plasmid T-DNA T-DNA (transferred) Ti plasmidu 1. geny pro biosyntézu auxinů a cytokininů = dediferenciace buněk a vznik nádorů (,,crown gall") 2. geny pro syntézu nádorově specifických látek, tzv. opinů (bazické aminokyseliny - oktopin, nopalin, manopin) = zdroj dusíku, uhlíku a energie pro bakterie odzbrojené vektory ­ původní geny odstraněny Agrobacterium rhizogenes indukce tvorby kořenů na segmentu kořene mrkve po infekci bakteriemi Agrobacterium tumefaciensAgrobacterium tumefaciens upravený binární vektor LhGR vir LhGR T-DNA KmR vir RifR KmR pBin+ GntR DNA agrobakteria část vlastního plazmidu upravený plasmid Selekční a signální markery kanamycin hygromycin gentamycin 4. GFP (,,green fluorescent protein" gen z medůzy Aequorea victoria) ­ detekce fluorescenčním mikroskopem 1. rezistence vůči antibiotikům cytostatikům (antimetabolika) herbicidům methotrexat 3. luc luciferáza (z mořského planktonu Photinus pyralis, katalyzuje ATP dependentní oxidativní dekarboxylaci substrátu = luciferin - za produkce světelné emise 562 nm) 2. iudA glukuronidáza ­ GUS - histochemická detekce Round-up, Basta Antibiotika využití pro selekci transgenních orgasnismů látky produkované různými druhy mikroorganismů, které potlačují růst jiných mikroorganismů (-statika), eventuelně je ničí (-cidy) dnes termín rozšířen i na syntetické sloučeniny s podobným účinkem nebo chemicky modifikované látky produkované mikroorganismy Klasifikace antibiotik 1. inhibitory syntézy bakteriální buněčné stěny 2. antibiotika ovlivňující permeabilitu membrán 3. bakteriostatické inhibitory syntézy proteinů 4. baktericidní inhibitory syntézy proteinů Peniciliny Amoxycillin Amoxycillin-klavunalát K Ampicilillin Carbenicillin Penicillin G Penicillin V Ticarcillin-klavunalát K Cephalosporiny Cefalexin Cefotaxim Kyselina klavunolová = specifický inhibitor -laktamázy 1. inhibitory syntézy bakteriální buněčné stěny 2. Antibiotika ovlivňující permeabilitu membrány antibakteriální antifungální Gramicidine Polymixin B Amphotericin Nystatin 3. Bakteriostatické inhibitory proteosyntézy reversibilní inhibice Chloramphenicol Doxycycline Erythromycin Tetracycline Oxyteracycline 4. Baktericidní inhibitory proteosyntézy aminoglykosidy Gentamycin Hygromycin B Kanamycin Neomycin Streptomycin inhibitory metabolismu NK Rifampicine Kyselina nalidixová antimetabolity Methotrexat Nitrofurantoin analogy NK 5-florouracil In vitro selekce rezistentních rostlin Selekce transgenních rostlin tabáku, které mají jako selekční marker myší gen dhfr pro dihydrofolátreduktázu rezistentní vůči methotrexatu (MTX) M-S médium s přídavkem MTX heterozygotní populaceheterozygotní populace 100% sensitivní kontrola100% sensitivní kontrola apex karafiátu substrát = 5-Br-4-Cl-3-indolyl--Dglukuronid (X-gluc) Indigogenní metoda detekce glukuronidázy Arabidopsis Indigogenní metoda detekce aktivity glukosidasy Transformované rostlinky kasavy regenerované z embryogenní kultury, signální gen = luciferáza rostlinky vizualizace luciferázy- postříkáno luciferinem a měřeno luminometrem Aequorea victoria Green Fluorescent Protein (GFP) has existed for more than one hundred and sixty million years in one species of jellyfish, Aequorea victoria. The protein is found in the photoorgans of Aequorea, see picture below right. GFP is not responsible for the glow often seen in pictures of jellyfish - that "fluorescence" is actually due reflection of the flash used to photograph the jellies. In Aequorea victoria a protein called aequorin releases blue light upon binding with calcium. This blue light is then totally absorbed by the GFP, which in turn gives off the green light http://www.conncoll.edu/ccacad/zimmer/GFP-ww/GFP-1.htm GFP jako marker Green Fluorescent Protein v buňkách tabáku konfokální obraz Osamu Shimomura byl první, kdo izoloval GFP z medůzy (,,jellyfish") Victoria aequorea a zjistil, která část GFP je zodpovědná za jeho fluorescenci. GFP Many other mutations have been made, including color mutants; in particular blue fluorescent protein (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), cyan fluorescent protein (ECFP, Cerulean, CyPet) and yellow fluorescent protein derivatives (YFP, Citrine, Venus, YPet). excitace při vlnové délce 395 nm a emise při 509 nm v zelené části viditelného spektra The diversity of GFP genetic mutations is illustrated by this San Diego beach scene drawn with living bacteria expressing 8 different colors of fluorescent proteins. Agrobacterium - média pro kultivaci LK médium (Langley et Kado) sacharóza 10 g kaseinhydrolyzát 8 g kvasničný extrakt 4 g KH2PO4 2 g MgSO4 0,3 g destil. H2O do 1000 ml agar 13 g LB BROTH High Salt (DUCHEFA) 25 g do 1000 ml destil. H2O složení: trypton 10 g (kaseinhydrolyzát) kvasničný extrakt 5 g NaCl 10 g agar 15 g Postup transformace - disková metoda 1. příprava kultury agrobakteria - křížový roztěr na LB médium s antibiotiky, ztužené agarem 2. příprava listových segmentů - předkultivace na MSH - s auxinem a cytokininem + agar (2 - 3 dny v kultiv. místnosti) 3. příprava suspenze agrobaktéria pro kokultivaci (LB médium) 4. kokultivace listových segmentů v suspenzi - 1 min. 5. osušení segmentů a přenos na povrch MSS média ­ inokulace svrchní stranou dolů 6. pravidelná pasáž na médium MSSa ( s antibiotiky) regenerace transgenních kalusů a rostlinek 7. indukce zakořeňování regenerovaných prýtů MSRa Transformace Arabidopsis vakuovou infiltrací Sarah J. Liljegren and Martin F. Yanofsky* Dept of Biology, Center for Molecular Genetics, University of California at San Diego, La Jolla, CA 92093-0116, USA Komerční využití GM rostlin je doposud omezeno: nedostatečnou znalostí kontroly exprese genů nedostatečnou vzájemných interakcí genů a regulací jednotlivých metabolických cest v rámci celé rostliny málo účinnými protokoly regenerace rostlin in vitro vysokými náklady na technologii genetické transformace rostlin obavami veřejnosti První povolená transgenní plodina The Flavr Savr tomato was the first commercially grown genetically engineered food to be granted a license for human consumption. It was produced by the Californian company Calgene, and submitted to the U.S. Food and Drug Administration (FDA) in 1992. It was first sold in 1994, and was only available for a few years before production ceased. Komerční využití GMO 1994 první povolená GM zelenina ­ rajčata Flavr-Savr s přidaným antisense genem, který interferuje s produkcí enzymu polygalakturonasy (RNA interference). Tento enzym je zodpovědný za měknutí buněčné stěny při dozrávání plodů (= zpomalené dozrávání a dlouhodobá trvanlivost v obchodě) 1996 první komerční osivo GM kukuřice v USA s rezistencí vůči zavíječi kukuřičnému 2000 Walmsley a Arntzen - vakcína proti průjmovému onemocnění (diarrhoea) v GM plodech banánů 2001 Potrykus - GM ,,zlatá rýže" s vyšší schopností akumulovat -karoten a železo Transgenní plodiny geneticky manipulované hospodářské a průmyslové plodiny kukuřice, pšenice, řepka, cukrovka, slunečnice, brambory, soja a bavlna mají zvýšený výnos a jsou rezistentní proti některým herbicidům a škůdcům transgenní ,, zlatá rýže " nese gen kukuřice pro tvorbu -karotenu (provitamin A) a má zvýšený obsah železa v přijatelné formě Zlatá rýže zvýšený příjem železa kořeny konstitutivní ukládání železa do stébel nese gen kukuřice pro tvorbu -karotenu (provitamin A) a gen pro feritin zrno má vyšší obsah -karotenu a zvýšený obsah železa v přijatelné formě pěstování zlaté rýže má ohromný význam pro zlepšení výživy, především u obyvatel Asie Komerčně úspěšné GM plodiny l Zlatá rýže se komerčně pěstuje v jihovýchodní Asii a významně přispívá k zlepšení zdravotního stavu populace v rozvojových zemích l V roce 2001 pěstovaly USA 68% světové výroby GM plodin, Argentina 22%, Kanada 6% a Čína 3% l Transgenní plodiny jsou důvodem dlouholetého sporu mezi EU a USA. Modifikované kukuřici, řepce a soji s rezistencí proti herbicidu Round-up (glyphosate) spotřebitelé v EU stále nedůvěřují. Komerčně úspěšné GM dřeviny a okrasné rostliny l Populus nigra tranformovaný genem CryAC (bakteriální toxin Bacillus thuringiensis) účinný proti housenkám motýlů (Lepidoptera). l Čína komerčně vysazuje a pěstuje porosty Populus nigra a Pinus nigra pro průmysl papírenský a textilní. l růže a karafiáty serie Moon, s modifikovanou vůní, firmy Suntory Ltd. (Japonsko) a Florigene Ltd. (Austrálie) jsou pěstovány v jižní Americe a prodávány v Evropě, USA, Kanadě, Japonsku, Austrálii. l transgenní modrá růže firmy Suntory byla získána přenosem genů pro tvorbu modrého barviva delfinidinu. Trendy výzkumu GM okrasných rostlin a lesních dřevin okrasné rostliny l oddálení stárnutí květů: změna biosyntézy etylénu l změny barvy květu: manipulace s geny pro biosyntézu antokyanů l změny vůně: manipulace s geny kodující S-linalolsyntázu l modifikace rezistence vůči patogenům a herbicidům lesní dřeviny l modifikace obsahu celulózy, snížení obsahu ligninu a změna jeho struktury ­ využití v papírenském průmyslu l rezistence proti fytopatogenním houbám (manipulace s geny kódujícími peptidy) a škůdcům l rezistence proti herbicidu Buster ­ méně pracné pěstování Doporučené adresy postup transformace v krocích a obrazech http://ceprap.ucdavis.edu/Transformation/transform11.htm transformace sóje http://www.cropsoil.uga.edu/soy-engineering/Transformation.html transformace sóje http://www.oardc.ohio-state.edu/plantranslab/ http://www.biotrin.cz/ GM potraviny http://www.csa.com/discoveryguides/gmfood/overview.php