Datum:                                                               

   Téma:   Iniciace kalusové kultury mrkve Daucus carota ssp. carota  L.

   Na segmentech různých orgánů většiny dvouděložných rostlin, obzvláště pokud jsou v segmentech
   přítomny meristematické buňky primárního nebo sekundárního meristému (stonkový nebo kořenový
   apikální meristém, kambium, felogén), se po inokulaci do vhodného média začnou buňky poměrně
   rychle dělit a vznikají neorganizované shluky buněk, tzv. kalus. Méně často se na tvorbě
   kalusu podílejí zralé, diferencované buňky.

   Materiál:             kořeny mrkve (karotky)  Daucus carota ssp. carota  L.

   Pomůcky:

   Médium: 1D = M-S ztužené 0,7% agarem s 2,4-D (0,1 mg/l)

   Postup práce:

   1.    Odstranit všechny nemocné, poškozené nebo nepravidelně utvářené kořeny.

   2.    Vydrhnout kořeny mrkve malým kartáčkem a mýdlem pod tekoucí vodou, odstranit veškeré
   povrchové nečistoty.

   3.    Segmenty kořenů asi 10 cm dlouhé desinfikovat ve 20% roztoku SAVO v SDV (v/v) za mírného
   míchání 20 minut (třepačka)

   4.    Oplachování 3x po dobu 3 minut v SDV, pro dostatečné odstranění desinfekčního roztoku

   5.    Přenos desinfikovaných segmentů ožíhanou pinzetou do sterilní Petriho misky

   6.    Sterilně v laminárním boxu ožíhaným skalpelem odříznout z každé strany kořenového
   segmentu 1 cm a segment přenést do další Petriho misky.

   

   7.    Krájejte příčné řezy kořenem o tloušťce asi 2 mm a z nich připravte díly o velikosti asi
   5x5 mm tak, aby obsahovaly ve střední části kambium. Velikost a tloušťka explantátů by měla
   být jednotná. Tento postup opakujte, až získáte dostatečný počet explantátů pro pokus. Po
   každé manipulaci uzavírejte víčko Petriho misky.

   8.    Ožíhejte okraj alobalového krytu a po jeho sejmutí i okraj zkumavky. Do každé zkumavky
   vložte 4 explantáty bazální řeznou plochou do agarového média D1 (M-S, 2% sacharóza, 0,1 mg/l
   2,4-D, 0,7% agar).

   9.    Mezi jednotlivými operacemi odkládejte skalpel a pinzetu do 96% ethanolu a opakovaně
   nástroje ožehávejte. Každý připraví 20 explantátů.

   10.  Po inokulaci ožíhejte opět okraj zkumavky a uzavřete krytem z alobalu a znovu ožehněte.

   11.   Zaznamenejte si počet segmentů v kultuře (v kultivační nádobě a počet nádob).

   12.  Zkumavky umístěte do termostatu a kultivujte ve tmě při teplotě 25°C.

   Hodnocení

   V následujících týdnech kontrolujeme čistotu kultur a vyhodnotíme četnost segmentů, na kterých
   došlo k  iniciaci tvorby kalusu.

   

   Téma:   Pasážování kalusové kultury mrkve Daucus carota ssp. carota  L.

   Za 4 týdny se většinou na explantátu vytvoří výrazný kalus a každý explantát by měl být
   rozdělen na 2 – 3 části ne menší než 5 x 5 mm a přenesen na čerstvé médium. Buňky na spodní
   straně explantátu jsou často nekrotické a nejsou vhodné pro další kultivaci. Tyto nekrotické
   části oddělte a odstraňte.

   Pomůcky:

   Postup:

    1. Přenést kultury z termostatu do laminárního boxu.
    2. Ožehnout alobal a po jeho sejmutí i okraj zkumavky.
    3. Ožíhanou pinzetou vyjmout explantát a přenést jej do sterilní Petriho misky.
    4. Po rozdělení inokulovat explantáty do zkumavky s čerstvým médiem.
    5. Ožehnout hrdlo zkumavky a dobře uzavřít alobalem.

   

+--------------------------------------------------------------------------------------------------+
|Plánovaný postup                                      |Dny od počátku pokusu                      |
|------------------------------------------------------+-------------------------------------------|
|Izolace čerstvých explantátů z kořene                 |                     0                     |
|------------------------------------------------------+-------------------------------------------|
|První pasáž                                           |                    28                     |
|------------------------------------------------------+-------------------------------------------|
|Výrazná proliferace kalusu                            |                  42 – 48                  |
|------------------------------------------------------+-------------------------------------------|
|Izolace vlastního kalusu                              |                  91 – 98                  |
|------------------------------------------------------+-------------------------------------------|
|Perioda pasážování kalusu                             |                  4 týdny                  |
+--------------------------------------------------------------------------------------------------+

   

   Výsledky:

   Zaznamenejte do protokolu detaily pokusu – datum počátku iniciace kalusové kultury, počet
   explantátů, počet kultur, četnost infekcí, různé použité postupy. Kultury kontrolujte
   v pravidelných týdenních intervalech a zaznamenejte změny v morfologii.

   Otázky:

    1. Ze kterého pletiva primárního explantátu pochází kalus?
    2. Rostou všechny explantáty stejně? Jaké důvody mohou vést k rozdílnému vývoji explantátů?

   Literatura:

   Reinert J. et Yeoman M.M. (1982) Plant Cell and Tissue Culture. – Springer-Verlag, Berlin