datum:

   Jméno:

   téma:  Testování bakteriální a houbové kontaminace kultur explantátů

   

   Materiál: Nodální segmenty kultur prýtů brambor, tabáku, karafiátů a maliníku, apod.

   Přítomnost latentních mikroorganismů v kultuře in vitro ovlivňuje její růst a vývoj,
   množitelský koeficient i aklimatizaci. Při kultivaci na klasických médiích používaných pro
   explantáty se kontaminace nemusí vždy projevit. Segmenty nebo prýty kultivovaných kultur se
   proto testují na různých selekčních médiích, které jsou pro rozvoj mikroorganismů příhodnější.
   Kultivací nodálních segmentů a prýtových disků kultur na širokospektrém médiu Leifert and
   Waites Sterility Test Medium (Leifert et al. 1989) nebo na médiu B523 (Viss et al. 1991)
   zjišťujeme bakteriální kontaminaci kultur.

   média:

   pevné agarové medium B523 (kaseinhydrolyzát 8 g.l^-1, MgSO[4] . 7 H[2]O 0,15 g.l^-1,
   K[2]HPO[4] 2 g.l^-1, kvasničný extrakt 4 g.l^-1., sacharosa 10 g.l^-1, agar 10 g.l^-1)

   kontrola: udržovací M-S medium

   

   postup:

   1.    Vyjmi prýty sterilní pinzetou z kultivační lahve a polož je na sterilní Petriho misku v
   aseptických podmínkách laminárního boxu.

   2.    Odděl apikální segmenty prýtů a inokuluj je do udržovacího média pro další kultivaci.

   3.    Rozřež zbylé prýty na jednotlivé nodální segmenty a tenké řezy.

   4.    Do agarového B523 média zanoř segment (řez), pomalu jej vytáhni, polož na povrch media a
   misku uzavři. Tímto postupem se inokulují spodní vrstvy media s nízkou koncentrací O[2,] která
   podporuje růst některých mikroorganismů.

   5.    Stejným způsobem inokuluj kontrolní misku s udržovacím M-S médiem.

   6.    Popiš misky s odpovídajícími segmenty, disky a apikálními segmenty prýtů.

   7.    Inkubuj inokulované Petriho misky ve tmě při 22-30˚C po 3 týdny.

   

   hodnocení

   V následujících týdnech kontrolujte čistotu kultur.

   Kolonie na povrchu pevného média nebo halo v médiu indikují přítomnost kultivovatelných
   mikroorganismů v kultuře.

   Porovnejte kontaminaci odpovídajících testovaných kultur na testovacím a MS médiu.

   Zapište výsledky.

   

   Literatura:

   Leifert et al. (1989): J. Appl. Bacter. 67: 351 – 361.

   Viss et al. (1991): In Vitro Cell Dev. Biol.-Pl. 27P,42.