Dělící techniky nukleových kyselin • Metody – Centrifugační – Elektromigrační – Chromatografické • Vlastnosti využívané pro dělení biomakromolekul – Molekulová hmotnost – Konformace a tvar – Náboj – Hustota Rozdělení centrifugačních technik • Diferenciální centrifugace - separace směsi heterogenních částic v homogenním roztoku • Zonální centrifugace - separace směsi částic s podobnými vlastnostmi v gradientním roztoku • Izokinetická centrifugace – separace podle rychlosti sedimentace částic • Stanovení sedimentačního koeficientu S • Izopyknická centrifugace – separace podle hustoty částic • Stanovení vznášivé hustoty r Typy centrifugace podle účelu – Preparativní centrifugace – Analytická centrifugace Centrifugační metody • Centrifugace patří k separačním metodám, které se v molekulární biologii používají k – Izolaci – Purifikaci – Charakterizaci informačních makromolekul a nadmolekulárních struktur • Základním principem separace založené na centrifugačních technikách je pohyb částic v tekutém prostředí pod vlivem odstředivého pole, které vzniká otáčením rotoru centrifugy • Chování částic při centrifugaci je dáno jejich fyzikálními vlastnostmi a povahou prostředí, v němž centrifugace probíhá. Teoretické principy centrifugace Výpočet relativní odstředivé síly • 1000×g, 5 min bakteriální buňky • 3000×g, 10 min chloroplasty, jádra • 10 000×g, 10 min mitochondrie, inkluzní tělíska • 40 000×g, 30 min membrány, mikrozómy, peroxizómy aj. • 200 000×g, 16 hr velké proteinové komplexy (ribozómy) • 400 000×g, 24 hr proteiny 50 kDa Nomogram pro přepočet relativní odstředivé síly (RCF) a otáček rotoru (rpm) Diferenciální centrifugace • Jestliže se centrifugaci v homogenním roztoku podrobí směs částic lišících se podstatně svou velikostí, hmotností nebo hustotou, budou jednotlivé složky směsi sedimentovat různou rychlostí. • Opakovanou centrifugací lze z původní směsi při postupném zvyšování otáček získat jednotlivé složky nebo frakce ve formě sedimentu. • Výchozí krok pro hrubou separaci a izolaci složek z lyzátů buněk nebo homogenátů tkání, např. – buněčných jader – ribozomů – mitochondrií Zonální centrifugace • Rychlost sedimentace jednotlivých komponent přítomných ve výchozí směsi není vždy odlišná natolik, aby je bylo možné diferenciální centrifugací oddělit – různé typy nukleových kyselin – ribozomální podjednotky – jiné částice, vykazující podobné vlastnosti • Pro oddělováni neboli separaci těchto látek se využívá zonální centrifugace, při níž je homogenní roztok v centrifugační zkumavce nahrazen roztokem, jehož koncentrace od povrchu ke dnu zkumavky narůstá. • Takový roztok se označuje jako gradientní roztok. • K jeho přípravě se používají dobře rozpustné a vůči analyzovaným částicím inertní látky – Sacharóza – Glycerol • Vzrůstající hustota a viskozita gradientního roztoku eliminují vliv zvyšujícího se odstředivého zrychlení směrem od osy otáčení, čímž brání nárůstu rychlosti sedimentace částic v průběhu centrifugace. Zonální centrifugace • Před zahájením centrifugace se vzorek obsahující směs částic nanese v tenké vrstvě na povrch gradientního roztoku v centrifugační zkumavce. • Jednotlivé složky výchozí směsi budou v závislosti na své velikosti, tvaru a hustotě sedimentovat gradientním roztokem různou rychlostí a vytvářet dobře oddělené zóny. • Gradient roztoku zároveň zabraňuje proudění uvnitř zkumavky, udržuje stabilitu a ostrost vytvořených zón a umožňuje jejich odebrání. Hustotní gradienty • Gradienty mohou být podle toho, zda se koncentrace roztoku mění plynule nebo stupňovitě. – Kontinuální – Diskontinuální • Diskontinuální gradient je předem připravený gradient v centrifugační zkumavce postupným navrstvováním roztoků o různé koncentraci. Vzorek je pak nanesen na jeho povrch. • V obou případech jsou po ukončení centrifugace částice příslušného druhu zkoncentrovány do úzkých pruhů, které lze detegovat a izolovat stejným způsobem jako při zonální centrifugaci. • K přípravě hustotních gradientů se používají látky, které se vyznačují vysokou rozpustností. • Běžně používanými látkami jsou. – chlorid cesný – sacharóza • Rozdíly v hustotách se pohybují v rozmezí 1,0-1,3 g/ml u sacharózy a 1,0-1,9 g/ml u CsCl, což umožňuje oddělit a izolovat např. buněčná jádra, mitochondrie, nukleové kyseliny atp. • Čistota získaných preparátů je vysoká. 2 typy zonální centrifugace Odběr frakcí po ultracentrifugaci v hustotním gradientu Sběr frakcí Izokinetická centrifugace • Volbou vhodných podmínek při zonální centrifugaci lze dosáhnout toho, aby rychlost sedimentace částic byla v průběhu centrifugace konstantní. • Tento způsob centrifugace se využívá k podrobnější charakteri-zaci částic, např. K přesnému stanovení jejich velikosti. • Při analýze nukleových kyselin se obvykle používá 5-20% sacharózový gradient, v němž se koncentrace sacharózy lineárně mění od hladiny ke dnu zkumavky. • Pohyb vytvořených zón lze monitorovat – Přímo během centrifugace pomocí speciálních zařízení (analytické centrifugy) – Stanovit polohu po ukončení centrifugace • Spektrofotometricky • Změřením radioaktivity jednotlivých frakcí • Rychlost, při níž částice sedimentuje, závisí na její velikosti, tvaru a hustotě a je ovlivňována vlastnostmi prostředí a podmínkami, při nichž centrifugace probíhá. Sedimentační koeficient • Veličina, kterou lze rychlost pohybu částice při izokinetické centrifugaci charakterizovat, se označuje jako sedimentační koeficient nebo též hodnota S. Rychlost sedimentace částice při centrifugaci lze vyjádřit obecným vztahem: dr/dt = S.a = s.w^2r, kde r je vzdálenost částice od osy otáčení, t je doba centrifugace, a je odstředivé zrychlení, S je sedimentační koeficient, w je úhlová rychlost rotoru při otáčení. • Po integraci uvedeného vztahu získáme rovnici pro sedimentační koeficient S = d(lnr)/w^2dt = lnr^2/r[1]/w^2(t[2]-t[1]), z níž lze vypočítat hodnotu sedimentačního koeficientu analyzované částice, jestliže známe její polohy r[1] a r[2] v centrifugační zkumavce v příslušných časových intervalech t[1] a t[2] a rychlost otáčení. • Abychom mohli srovnat hodnoty S stanovené při různých podmínkách centrifugace, jsou získané hodnoty přepočítány na standardní sedimentační koeficient S^o[20,w], které charakterizují rychlost sedimentace částic o koncentraci blízké nule ve vodě při 20°C. • Hodnoty sedimentačních koeficientů se pro většinu informačních makromolekul a molekulárních komplexů pohybují v rozmezí řádů 10-11 až 10-13 sekund. • Vyjadřují se proto ve Svedbergových jednotkách (S), kde 1 S (Svedberg) = 10-13 sekundy. • Hodnot sedimentačních koeficientů se využívá k popisu a charakterizaci informačních makromolekul, buněčných organel a jejich struktur. • Příkladem je označování jednotlivých druhů – ribozomových RNA • 23S-rRNA • 16S-rRNA – ribozomových podjednotek • 30S • 50S • Pro jednotlivé typy informačních makromolekul lze pomocí empirických vztahů z hodnot sedimentačních koeficientů vypočítat rovněž jejich molekulové hmotnosti. Příklady hodnot standardních sedimentačních koeficientů S^o[20,w ]Výpočet molekulové hmotnosti DNA z hodnoty S S^o[20,w] = a . M ^K M = molární hmotnost nukleové kyseliny a, K = empirické konstanty Výpočet srovnáním s vnitřním standardem L= vzdálenost od hladiny M = molární hmotnost K = empirická konstanta Izopyknická centrifugace • Při této metodě centrifugace, označované též jako hustotní centrifugace nebo centrifugace do rovnováhy, se částice oddělují podle své hustoty. • Nejjednodušší provedení této metody spočívá v přípravě homogenní směsi analyzovaných částic ve vhodném mediu a následné centrifugaci. • Během centrifugace tato media sama vytvoří koncentrační a tím i hustotní gradient, v němž se částice analyzovaných látek pohybují oběma směry tak dlouho, dokud nedosáhnou polohy, v níž je hustota roztoku shodná s hustotou částic. • Takto stanovená hustota se označuje jako vznášivá hustota. Její hodnoty jsou ovlivněny interakcí částic s ionty roztoku a jsou obvykle vyšší než je hustota částic v buňkách. Stanovení vznášivé hustoty izopyknickou centrifugací r^25 °C = 10,8601 × n^D[25 °C] – 13,4974 n^D[25 °C] = index lomu roztoku CsCl Výpočet % (G+C) • Separace částic na základě jejich odlišné hustoty se používá k jejich izolaci a charakterizaci. • Je známo, že na vznášivou hustotu dvouřetězcové DNA má vliv zastoupení jednotlivých typů párů bází, čehož se využívá ke stanovení podílu GC-párů ve vzorcích DNA. • Platí, vztah % (G+C) = (r - 1,660/0,098) .100 kde r = vznášivá hustota vzorku dvouřetězcové DNA. Separace různých forem DNA • Speciálním případem využití izopyknické centrifugace je rozdělení odlišných strukturních typů DNA v gradientech CsCl za přítomnosti etidium-bromidu. • Po navázání etidiumbromidu na DNA se její vznášivá hustota významně snižuje, přičemž množství navázaného etidiumbromidu a tím i pokles hustoty DNA závisí na jejím strukturním typu. • To umožňuje vzájemně separovat a izolovat různé formy DNA, např. kovalentně uzavřené kružnice plazmidových DNA od otevřených a lineárních molekul plazmidové a chromozomové DNA.