Metody molekulární diagnostiky Molekulární diagnostika Metody pro detekci polymorfizmů v genomech metody elektroforetické a hybridizační Metody studia sekvenčního polymorfizmu DNA • 1. Přímá metoda: – Sangerovo sekvencování – Pyrosekvencování – Pomocí čipů • 2. Nepřímé metody: fingerprinting (otisky DNA) – RFLP – polymorfizmus délek restrikčních fragmentů – AFLP – polymorfizmus délek amplifikovaných fragmentů – SSLP– polymorfizmus délek fragmentů s jednoduchou repeticí – CFLP– polymorfizmus délek fragmentů vytvořených kleavázou – SSCP – polymorfizmus konformace jednořetězců – DSCP – polymorfizmus konformace dvouřetězců • 3. Metody pro specifickou detekci jednonukleotidových polymorfizmů Složky prokaryotického genomu a jejich využití pro subtypizaci Analýza celkové chromozomové DNA • Analýza počtu chromozómů (kvasinky Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Candida; protozoa; Aspergillus) • Polymorfizmus délky restrikčních fragmentů, restrikční analýza (RFLP) – Analýza malých fragmentů – Analýza velkých fragmentů – Makrorestrikční analýza (pulzní gelová elektroforéza) • Selektivní hybridizace se sondou (Southernův přenos restrikčních fragmentů na membránu a následná hybridizace) Princip RFLP Restrikční analýza chromozomální DNA (REA) • Jedna z prvních DNA typizačních metod zahrnující analýzu počtu a velikosti restrikčních fragmentů vznikajících štěpením specifickou restrikční endonukleázou (RE). • Rozdíly mezi fragmenty se označují jako polymorfizmus délek restrikčních fragmentů (RFLP). • Metoda restrikční analýzy zahrnuje následující kroky: – izolace chromozomární DNA – výběr vhodné RE. – štěpení RE, která rozpoznává 4 až 6 bp dlouhé sekvence – standardní elektroforéza DNA fragmentů o velikosti 20 000 - 1000 bp v agarózovém gelu – vizualizace barvením v etidiumbromidu a densitometrické vyhodnocení Analýza velkých nebo malých fragmentů • Nevýhodou RE analýzy celkové chromozomální DNA je velké množství vytvářených restriktů s podobnou pohyblivostí v tradičním agarózovém gelu. • Výsledkem je spektrum pruhů vizuálně obtížně odlišitelných. • Pro přesné vyhodnocení míry podobnosti spekter je nutné použít – densitometrické měření – korelační srovnání densitometrických křivek • Analýzu zjednodušit hodnocením pouze • malých fragmentů 50 – 1000 bp (PAGE + barvení stříbrem) • velkých fragmentů 5 - 15 kb (FIGE) • Přes uvedené obtíže byla REA použita ke studiu příbuznosti u řady bakteriálních druhů Campylobacter, Legionella, Neisseria, Staphylococcus, streptokoky aj. Makrorestrikční analýza chromozomální DNA pomocí PFGE • Metoda slouží pro stanovení RFLP genomové DNA při použití restrikčních endonukleáz, které štěpí DNA na < 30 místech. • Vznikají velké fragmenty chromozomální DNA (10 - 1000 kbp), které jsou separovány pulzní gelovou elektroforézou. • Pro izolaci intaktní DNA není vhodná konvenční metoda, ale používá se specifický postup. Příprava vzorků pro PFGE • Kultivace buněk do přesně stanovené hustoty • Smíchání buněk s roztavenou agarózou • Nalití směsi do malé formičky • lyze buněk v agarózových bločcích • deproteinace DNA • Štěpení restrikční endonukleázou, která štěpí s nízkou frekvencí (velikost fragmentů 50 - 10 000 kbp) • Pulzní elektroforéza • Barvení gelu v etidiumbromidu Výběr vhodných restrikčních enzymů pro makrorestrikční analýzu DNA Intrpretace výsledků PFGE při typizaci bakterií Analýza plazmidové DNA • Analýza obsahu a počtu plazmidů • Restrikční analýza plazmidové DNA (REAP) • Hybridizace se sondou - detekce specifických genů pro – virulenci – rezistenci k antibiotikům a antimikrobiálním chemoterapeutikům • Přenos plazmidů mezi kmeny (i mezi různými druhy a rody) se může uskutečňovat: • Konjugací 2. Transdukcí 3. Fágem zprostředkovanou konjugací • Plazmidová analýza je rychlá, jednoduchá a levná metoda. • Má následující nevýhody: – kmeny bez plazmidů jsou netypovatelné – interpretace plazmidových profilů není jednoznačná (superhelicita) – dlouhodobá stabilita plazmidů je diskutabilní • Příklad analýzy plazmidů u Staphylococcus aureus z epidemie na JIP v Olomoucké nemocnici. • V současné době se plazmidová analýza používá jako doplňková typizační metoda u gramnegativních (Salmonella, Neisseria, Escherichia) i grampozitivních (Staphylococcus, Enterococcus, Helicobacter) bakterií. Příklad detekce genu pro exfoliativní toxin na plazmidech kmenů S. aureus Polymorfizmus délky genomových segmentů u virů se segmentovaným genomem Selektivní hybridizace restrikčních fragmentů (SRFH) • DNA hybridizační diagnostické metody využívají Southernův přenos (1975) pro detekci a lokalizaci vybraných sekvencí, což umožní zjednodušení RFLP analýzy snížením počtu srovnávaných fragmentů. • Základní metodické kroky při SRFH – štěpení celkové chromozomální DNA restrikčním enzymem – separace fragmentů pomocí elektroforézy – přenos fragmentů z gelu na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu – hybridizace DNA navázané na membráně s jednou nebo více značenými sondami homologickými se zkoumanými geny – detekce navázané sondy • sondy značené radioizotopy + autoradiografie • sondy značené neradioaktivně (digoxigenin, biotin, fluorescein, atd.) a následná detekce zahrnující enzym (AP) a barvotvorný substrát nebo enzym a chemiluminiscenční substrát – vyhodnocení RFLP Princip selektivní hybridizace Přehled používaných sond pro SRFH u prokaryot • Náhodně klonované sondy – Relativně stabilní oblasti bakteriálního chromozómu • Použití: Legionella, Brucella • Sondy specifické pro geny kódující metabolické faktory nebo faktory virulence – Sondy je nutné připravit individuálně pro určité bakteriální druhy, tzn. že tento přístup není použitelný obecně. – Sekvence některých genů jsou velice konzervativní a jsou proto nevhodné k přípravě sond, naopak geny s určitou sekvenční variabilitou, případně geny vyskytující se ve více kopiích jsou velice vhodné. • Použití: Pseudomonas aeruginosa: gen pro exotoxin A • Staphylococcus aureus: mec (determinant meticilinové rezistence) – Genově specifické sondy je možné využít k hybridizaci s makrorestrikčními fragmenty separovanými pomocí PFGE • Sondy odvozené z vícekopiových elementů typu inzerčních sekvencí a transpozonů – Inzerční sekvence (IS) jsou transponovatelné repetitivní DNA elementy nacházející se v genomu prokaryotických a eukaryotických organizmů. – Přítomnost elementu na určitých místech chromozómu je odrazem chromozomálních přestaveb během evoluce. – Hybridizace se sondami připravenými z IS elementů vykazují vysokou reprodukovatelnost a vysokou diskriminační schopnost související s přítomností těchto elementů ve více lokusech na chromozómu. – Bakteriální IS elementy mají na koncích obvykle 10-40 bp dlouhé obrácené repetice, sonda se proto připravuje z vnitřních sekvencí elementu. – Výběr restrikční endonukleázy a vhodného elementu pro přípravu sondy je nutné provést pro každý bakterální druh. • Použití: Mycobacterium tuberculosis IS6110 • další druhy mykobakterií • Staphylococcus aureus IS257/431 • Sondy připravené z dalších repetitivních sekvencí – Pro stanovení polymorfizmů metodou SRFH byly použity některé krátké repetitivní sekvence obecně přítomné v genomech organizmů. – Pouze některé repetice jsou obecně použitelné: • 15-bp repetice z pozdního genu coa z bakteriofága M13 – Escherichia coli – Staphylococcus • polymorfní tandemová repetice z mykobakterií – Mycobacterium tuberculosis (MPTR-SRFH) • repetitivní sekvence označovaná BOX – Streptococcus pneumoniae • náhodné trinukleotidové repetice jako např. (GTG)5 – Salmonella, Shigella a Mycobacterium. • Sondy připravené z dalších variabilních genetických elementů integrovaných v chromozómu • Profágy • Plazmidy Příklad detekce profágů integrovaných v bakteriálním genomu selektivní hybridizací DNA se 3 sondami specifickými pro různé fágové serologické skupiny, značenými biotinem, digoxigeninem a fluoresceinem • Ribotypizace - Sondy připravené z 16S rRNA nebo 23S rRNA (rDNA-SRFH, rDNA-RFLP) • Ribotypizace je nejvšestrannější a nejvíce využívaná strategie pro získání informace o polymorfizmu bakteriálního genomu. • Historie: – 1965 - bylo zjištěno, že sekvence ribozomální RNA mohou být využitelné ke stanovení příbuznosti organizmů – 1980 - poprvé byl použit termín ribotyp – 1981 - byla potvrzena teorie, že ribozomální RNA všech organizmů pochází ze společného předka – 1983 - byla patentována metoda charakterizace organizmů na základě ribozomálních DNA sekvencí – 1986 - ribotypizace byla použita pro srovnávací studii 41 různých bakteriálních druhů – od 1990 - široké využití v oblasti lékařské a veterinární epidemiologie, patologie, zjišťování kontaminace potravin atd. – 1995 - Bylo zavedeno automatizované zařízení RiboPrinter pro fingerprinting DNA bakterií. Charakteristika bakteriálního rrn operonu • rRNA-operon (rrn operon) se vyskytuje na bakteriálním chromozómu v několika kopiích. Princip ribotypizace • Ribotypizace zahrnuje fingerprinting restrikčních fragmentů genomové DNA, které obsahují celý nebo část genu kódujícího 16S a 23S rRNA. • Hlavní výhody ribotypizace: – Sekvence genů pro ribozomální RNA jsou velice konzervativní, proto pro ribotypizaci všech Eubakterií může být použita jediná sonda. – Jelikož většina bakterií obsahuje několik ribozomálních operonů, získáme po hybridizaci dostatečné množství fragmentů umožňujícíci mezidruhové i vnitrodruhové odlišení kmenů. Automatizace ribotypizace Sondy používané pro SRFH u eukaryot • Jednolokusové sondy – Hybridizují k jedné hypervariabilní oblasti genomu a vytvářejí vzor o 1-2 proužcích – Pro identifikační účely se používá směs („kokteil“) jednolokusových sond – Jsou citlivější a dávají jednodušší obraz než multilokusové sondy – Pro hybridizaci je třeba min 10 ng DNA • Mnoholokusové sondy – Hybridizují k repetitivním sekvencím vyskytujícím se s četností 100 – 1000 v genomu – Při Southernově hybridizaci se detekuje 20 – 30 proužků – U člověka se využívá minisatelitů, z nichž 60 má společnou konvenční sekvenci – Délka repeticí u každé z alel je polymorfní – Pravděpodobnost, že 2 jedinci budou mít stejnou délku 1 repetice po štěpení restriktázou HinfI je 0,25. Pokud uvažujeme 36 detekovatelných lokusů (proužků), je pravděpodobnost výskytu stejného vzoru 0,25^36=10^-22 – Nevýhodou je vysoký nárok na množství DNA (250 ng) – Příklad hybridizace se sondou připravenou z minisatelitu v myoglobinovém genu s konvenční sekvencí GGAGGTGGGCAGGANG • Sondy z transponovatelných sekvencí – Transpozony – Retrotranspozony • Sondy z dlouhých roztroušených elementů (LINEs) • Sondy z krátkých roztroušených elementů (SINEs) • STRs (short tandem repeats) tetranukleotidové repetice analyzované pomocí multiplex PCR s následným sekvencováním ve 4 lokusech u člověka nahradily od roku 1994 hybridizační metody pro identifikační účely Interpretace elektroforetických vzorů proužků a konstrukce dendrogramů • Otisk DNA je výsledkem většiny molekulárních metod. • Získaný vzor, který je viditelný na obarvených elektroforetických gelech nebo vyvolaných hybridizačních membránách – Je specifický pro izoláty určitého klonálního původu – Vzorem se rozumí skladba určitých znaků (kvantitativně vyjádřených) jimiž se vyznačuje daný objekt. – Znakem je fragment DNA určité velikosti, u kterého se hodnotí přítomnost nebo nepřítomnost nebo jeho plocha. • Při DNA-typizaci jedinců získáme velkou množinu dat, kterou je třeba převést do prezentovatelné formy určením tříd nebo skupin. • K tomuto účelu se využívá shluková analýza – využívá se k nalezení hierarchického seskupování množin dat s mnoha proměnnými – redukuje počet objektů jejich umístěním do skupin Shluková analýza • Metody nehierarchické – dávají jednoduché rozdělení, které optimalizuje homogenitu uvnitř skupiny • Metody hierarchické – členové níže zařazených shluků se stávají členy větších výše zařazených shluků, výsledkem je zobrazení souhrnu jejich hierarchie • Dělící – Začínají s předpokladem, že všechny objekty jsou částí jednoho shluku – Algoritmus štěpí tento velký shluk krok za krokem dokud každý objekt netvoří samostatný shluk • Aglomerační – Na začátku každý shluk obsahuje jeden objekt – Shluky jsou postupně spojovány – cílem obdržet přímé znázornění příbuznosti mezi objekty • Výsledek hierarchického shlukování je obvykle zobrazen jako dendrogram, ve kterém jsou zobrazeny následné jednotky shluků společně s hodnotami podobnosti vedoucím k těmto jednotkám Algoritmus hierarchických aglomeračních metod shlukování • Vytvoření množiny dat. • Soubor hodnot, které nabývají objekty na základě množství znaků. • Transformace dat. • Sjednocení jednotek, vyřazení kvalitativně rozdílných znaků. • Sestavení matice podobnosti nebo rozdílnosti. • Na základě měření podobnosti nebo rozdílnosti každého páru objektů. • Shlukování. • Výběr vhodného algoritmu, což je v podstatě vztah pro opakovaný výpočet rozdílnosti nebo podobnosti nového shluku s ostatními shluky. • Dendrogram. • Znázornění postupného shlukování jednotlivých objektů grafickou formou. Měření podobnosti. • Při určování podobnosti elektroforetického vzoru (dvou drah proužků) a tím i podobnosti mezi dvěma izoláty se využívají koeficienty podobnosti založené na – Přítomnosti nebo absenci proužků – denzitometrických hodnotách. • Koeficienty založené na proužcích – Jaccardův koeficient: – Diceho koeficient: – Plošně citlivý koeficient: Nejčastěji používané metody pro shlukování • Metoda nevážených průměrů párových skupin (unweighted pair group average method, UPGMA). – Shluky jsou spojovány na základě průměrné vzdálenosti mezi všemi členy ve dvou skupinách. – Tato metoda se využívá při vyhodnocování otisků DNA (elektroforetických vzorů) • Jednoduché spojování (neighbour joining, metoda nejbližšího souseda). – Shluky jsou spojovány na základě nejmenší vzdálenosti (největší podobnosti) mezi dvěmi skupinami. – Metoda má použití při sestavování fylogenetických stromů odvozených z porovnávání částečných sekvencí konzervovaných genů, např. 16S a 23S rRNA.