Klonování Klonování: proces tvorby klonů Klon: soubor geneticky identických buněk (resp. organismů), odvozených ze společného předka Klonování DNA: tvorba klonů DNA Klon DNA: soubor identických molekul, fragmentů nebo úseků DNA, připravených např. množením rekombinantních molekul DNA v hostitelské buňce (in vivo) nebo PCR (in vitro) Rekombinantní molekula DNA: molekula DNA vytvořená spojením cizorodé (klonované) DNA s klonovacím vektorem Klonování DNA Stěžejní metoda molekulární biologie: umožňuje izolovat z komplexního genomu jeho dílčí úseky (např. geny), ty ve formě rekombinantních molekul mnohonásobně zmnožit a zpřístupnit je tak dalšímu studiu Využití klonování DNA: • izolace genů • studium regulačních oblastí, které řídí genovou expresi • fyzikální a genetická analýza genomů • exprese cizích genů v nepříbuzných hostitelích (heterologní exprese) za účelem přípravy žádaných produktů • základ genového inženýrství (příprava transgenních organismů) Postup klonování DNA • příprava rekombinantní molekuly DNA • přenos rekombinantní DNA do hostitelské buňky • zmnožení rekombinantní DNA v hostitelské buňce • zmnožení hostitelských buněk obsahujících rekombinantní DNA • Identifikace klonů buněk nesoucích rekombinantní DNA Pro zajištění klonování jsou nezbytné klonovací vektory Klonovací vektory - funkce • zajištění přenosu studované DNA do hostitelské buňky (obvykle bakterie) • zajištění propagace vlastní struktury vektoru, včetně klonované sekvence v hostitelské buňce • zajištění segregace do dceřinných hostitelských buněk • mnohonásobným množením transformované buňky vzniká klon identických buněk, z nichž každá obsahuje jednu nebo více kopií rekombinantní DNA: nesený gen je klonovaný Klonovací vektory-základní struktura • nejčastěji kružnicové molekuly DNA schopné autonomní replikace • obvykle odvozené z plazmidů nebo virů • navíc obsahují pomocné sekvence různého původu usnadňující vložení cizorodé DNA, její expresi, selekci transformantů, apod.) • pro vektory je výhodná malá velikost (do 10 kb) – usnadnění purifikace a manipulace Typy vektorů Plazmidové: pBR322, pUC18, BACs Fágové: - odvozené od bakteriofága Lambda - odvozené od fága M13 Kosmidy: hybridy mezi plazmidy a fágy Vektory pro eukaryontní buňky: - kvasinkové - rostlinné - živočišné Plazmidové vektory Vlastnosti: • jednoduchá manipulace • přirozený výskyt v mnoha druzích bakterií • variabilita ve velikosti: jednotky kb – stovky kb (pro klonování obvykle 2-15 kb) • většina odvozena od plazmidu ColE1 bakterie E. coli Přirozené plazmidy Neintegrační plazmidy • extrachromozomální molekuly DNA, obvykle kruhové, dvouřetězcové, tvořící nadšroubovici • obsahují vlastní počátky replikace • replikují se nezávisle na chromozomu • menší plazmidy využívají ke své replikaci enzymy hostitelské buňky, větší si kódují vlastní Integrační plazmidy - epizomy • molekuly DNA, které se replikují jako součásti bakteriálního chromozomu • v určité fázi se vyčlení a existují jako samostatné elemnety Klasifikace plazmidů dle znaků kódovaných plazmidovými geny • Fertilitní plazmidy (F plazmidy) nesou pouze geny tra (řídící konjugaci) , stimulují konjugativní přenos plazmidů (např. F plazmid E. coli) 2. Rezistenční plazmidy (R plazmidy) nesou geny, které hostitelům poskytují rezistenci k jednomu nebo více antibakteriálním látkám (např. RP4 plazmid Pseudomonas) 3. Col plazmidy kódují koliciny, které zabíjejí jiné bakterie (např. ColE1 plazmid E. coli) 4. Degradativní plazmidy umožňují hostiteli metabolizovat neobvyklé molekuly jako např. toluen nebo kyselinu salicylovou (TOL plazmid Pseudomonas putida) 5. Virulentní plazmidy propůjčují hostiteli virulenci (např. Ti plazmid Agrobacterium tumefaciens, způsobující tvorbu nádorů u dvouděložných rostlin) Přirozené plazmidy • typ bakteriálního parazita ve formě DNA: schopnost replikace uvnitř bakterie, občasný přechod do jiné buňky • výhoda poskytovaná plazmidem hostitelské buňce je zároveň výhodou pro plazmid • zodpovídají za šíření genů pro rezistenci k antibiotikům • je zakázáno provádět takové experimenty, které by mohly způsobit rozšíření nových genů pro rezistenci k antibiotikům v patogenních bakteriích Charakteristika plazmidových vektorů • autonomní replikace v bakteriální buňce • tvorba více kopií v buňce • schopnost stabilního udržení cizorodé DNA při replikaci, nepřenosnost do dalších buněk konjugací (bezpečnost práce s novými konstrukty) • přítomnost restrikčních (klonovacích) míst, využitelných pro klonování • snadný a účinný přenos do hostitelských buněk • přítomnost jednoho nebo více markerů pro selekci hostitelské buňky (např. rezistence na antibiotikum) • malá velikost (zvýšení účinnosti transformace, jednoduchá izolace) Replikace plazmidů • základní předpoklad pro využití plazmidů jako klonovacích systémů (namnožení fragmentu DNA) • hostitelské buňka je vybavena veškerým aparátem pro replikaci DNA Počátek replikace (ori) - genetická informace, kterou musí plazmid disponovat, aby mohl být v bakteriální buňce replikován - je tvořen jen několika stovkami párů bazí Tvorba více kopií plazmidu v buňce • deriváty ColE1 jsou „multi-copy“ plazmidy • ColE1 divokého typu – cca 15 kopií v 1 buňce • uměle vylepšené deriváty – několik set kopií • faktory řídící počet kopií plazmidů v buňce nejsou jasné Výhody - snadná purifikace s vysokými výtěžky - vysoká exprese klonovaného genu Nevýhody: - pomalejší růst hostitelské buňky - nadměrná exprese klonovaného genu může být pro buňku zátěž Plazmidy a rozmezí hostitelů • některé plazmidy se replikují v rozmanitých bakteriálních druzích (široké rozmezí hostitelů): RP4, RSF1010, pC194 • většina vektorů užívaných pro klonování se replikuje jen v úzkém rozmezí hostitelů Výhoda: - snížení rizika rozšíření pozměněné genetické informace Nevýhoda: - pokud potřebujeme experimentovat s jinými bakteriemi než E. coli musíme si připravit „vlastní vektor“ se specifickým ori Pendlující (bifunkční, „shuttle“) vektory pJK3-1, pKT240, PGC3311 • možný přenos mezi dvěma bakteriálními druhy • 2 místa ori v jednom plazmidu Klonovací místo • unikátní restrikční místo (zastoupené pouze jednou v molekule plazmidu), do kterého se začleňuje cizorodá DNA • větší počet různých restrikčních míst se obvykle seskupuje do krátkého úseku DNA (mnohočetné klonovací místo, polylinker) • poloha klonovacího místa nesmí narušit funkci oblasti ori nebo jiné důležité funkce plazmidu • začlenění fragmentu DNA do určitého klonovacího místa vede k vzniku rekombinantního plazmidu se dvěma cílovými místy téhož restrikčního enzymu - možno využít pro identifikaci rekombinantního plazmidu Selekční markery • nezbytné pro funkci vektoru • procesy ligace i transformace jsou málo účinné: max. 1% bakteriálních buněk (E. coli) DNA přijme, v praxi obvykle méně • nutno rozlišit transformované buňky (menšinu) od většiny netransformovaných buněk (tj. zabránit v růstu netransformovaným buňkám) • obvykle zajištěno genem, který hostitelským buňkám poskytne rezistenci na antibiotikum Gen bla • kóduje enzym b-laktamázu • b-laktamáza hydrolyzuje -laktamová antibiotika (příbuzná penicilinu), např. ampicilin • mění tato antibiotika na formu, která není pro bakterii toxická Ne přítomnost plazmidu, ale exprese nesených genů rozhoduje o rezistenci • není vhodné transformanty okamžitě vysévat na selekční médium • po teplotním šoku je třeba buňky krátce kultivovat v médiu bez antibiotik • čas je nutný pro expresi genu, který hostitelské buňce zajistí přežití v selekčních podmínkách Identifikace bakteriálních kolonií obsahujících rekombinantní plazmidy • selekce transformantů neřeší problém varianty neseného plazmidu • rezistenci zajistí „prázdný“ i rekombinantí vektor Problém řeší: • restrikční analýza plazmidové DNA • inzerční inaktivace • alfa-komplementace Restrikční analýza • začlenění klonované DNA změní restrikční vzorec (přítomnost nových restrikčních míst) • je třeba izolovat plazmidy z jednotlivých klonů transformantů, štěpit je vhodnou restrikční endonukleázou a provést gelovou elektroforézu • vhodný způsob zjištění orientace klonovaného fragmentu Inzerční inaktivace • fenotypový projev úspěšného začlenění fragmentu DNA do klonovacího místa v transformovaných bakteriích • přímá identifikace kolonií nesoucích rekombinantní plazmid Inzerční inaktivace • klonovací místo je ve vektoru (např. pBR322) umístěno v genu zodpovědném za rezistenci hostitelské buňky k antibiotiku • inzerce klonované DNA způsobí ztrátu funkce tohoto genu • buňky nesoucí rekombinantní plazmid jsou k danému antibiotiku citlivé, buňky nesoucí prázdný vektor jsou rezistentní Alfa-komplementace • klonovací místo (např. plazmidu pUC18) je umístěno v blízkosti 5´konce genu lacZ kódujícího b-galaktozidázu • buňky obsahující plazmid pUC8 jsou amp^r a mohou tvořit b-galaktozidázu • přítomnost klonovacího místa nenarušuje čtecí rámec lacZ, pouze k tomuto genu přidává několik kodonů, funkce produktu (hydrolýza laktózy) tím není narušena (modré kolonie na plotnách s chromogenním substrátem) • včleněním klonovaného fragmentu DNA do klonovacího místa vektoru se přeruší sekvence lacZ , kolonie jsou amp^r, ale b-galaktozidázu tvořit nedokážou (bílé kolonie na plotnách s chromogenním substrátem) • pUC18 nese jen část genu lacZ, zbytek genu poskytuje hostitelská bakterie (princip komplementace) Kultivační podmínky pro detekci aktivity -galaktozidázy v bakteriích • místo štěpení laktózy na galaktózu testujeme odlišnou reakci katalyzovanou tímto enzymem: • substrátem je látka analogická laktóze X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-galaktozid), která se -galaktozidázou štěpí na zabarvený produkt • induktorem enzymu je IPTG (izopropyltiogalaktozid) • X-gal a IPTG se přidávají spolu s Amp do agarového média Výhody alfa-komplementace Jednoduše poskytuje informace o úspěšnosti ligace: • bakterie přijala plazmid (je Amp^R) • bílá barva kolonie signalizuje, že přijatý plazmid nevznikl recirkularizací prázdného vektoru Nevýhody alfa-komplementace • pokud je inzert malý a nepřerušuje čtecí rámec, -galaktozidáza může mít dostatek aktivity pro zmodrání kolonií • bílá kolonie nemusí vždy znamenat důsledek úspěšného klonování (delece v MCS, včlenění nežádoucího úseku DNA, který poruší čtecí rámec) Vektory pro speciální účely • expresní vektory: obsahují promotor, kterým lze zajistit produkci cizího proteinu v hostitelských buňkách (vhodné inducibilní systémy) • kyvadlové vektory: obsahují dva počátky replikace – možnost propagace ve dvou různých organismech (např. E.coli a B. subtilis) Lysogenní a lytický cyklus • Lambda je temperovaný bakteriofág (po infekci E.coli může podstoupit lytický nebo lysogenní cyklus) • rozhodují vlivy okolí, genetická charakteristika hostitele i fága • existují mutanti fága Lambda podstupující pouze lytický cyklus (jasné plaky) • divoký typ poskytuje zakalené plaky (přítomnost lysogenů rezistentních k další infekci fága: „superinfection immunity“) Lysogenie • exprese téměř všech fágových genů je vypnuta fágovým represorem (produkt genu cI) • spontánní represe není absolutní • reparační mechanismy aktivované poškozením DNA (UV záření) ničí represor CI (přechod na lytický cyklus) • genom Lambda je obvykle integrován do genomu hostitele místně specifickou rekombinací a spolu s ním replikován • genom Lambda může být replikován i v extra-chromozomálním stavu Genom fága Lambda • dvouřetězcová lineární DNA (48.514 bp) • 12 nespárovaných, ale komplementárních bází na obou koncích (lepivé konce) • párování koncových sekvencí je vzhledem k jejich délce stabilní i při 37^oC • v infikované buňce se objevuje i kruhová struktura: důsledek kovalentní vazby katalyzované bakteriální DNA ligázou Lepivé konce DNA fága Lambda Lytický cyklus • kruhová DNA se nejdříve replikuje obdobně jako plazmidy: vznik dceřinných kruhových molekul • později se replikace přepíná na „otáčející se kruh“: vznik dlouhých lineárních molekul DNA, obsahujících mnoho spojených kopií genomu Lambda (konkatemery) Replikace DNA fága Lambda Sestavování fágových částic • exprese fágových genů • sestavení prázdné fágové hlavy • sbalení DNA • připojení bičíku Sbalení DNA („DNA packaging“) • enzymy rozeznávají specifická místa na molekule DNA obsahující mnoho kopií fágového genomu (konkatemerů) a provedou v nich asymetrická štěpení: vznik lepivých konců („cohesive end sites“ - cos) • oblast vymezená 2 místy cos je sbalena a přenesena do fágové hlavy Lýze bakteriální buňky • zajištěna produktem fágového genu S • mutace v genu S způsobuje oddálení nebo úplné selhání lýze (využívají některé vektory pro zvýšení výtěžku bakteriofága v důsledku vícenásobné replikace) Vektory fága lambda mají 2 omezení • molekulu DNA lambda lze zvětšit jen asi o 5%, což odpovídá přidání pouze cca 3 kb nové DNA (větší molekuly se nazabalí do fágové hlavy) • genom lambda je tak velký, že obsahuje cílová místa pro všechny běžné restriktázy (komplikace pro klonování, riziko rozpadu vektoru) Zvýšení klonovací kapacity vektoru lambda • odstranění postradatelných genů, které zajišťují lysogenní cyklus (integraci a vyštěpení profága) – cca 15 kb • zmenšený genom není lyzogenní a prochází pouze lytickým cyklem Odstranění cílových míst pro RE • mutageneze in vitro (štěpení RE, modifikace konců DNA, zpětná ligace) • přirozená selekce - hostitelem je např. kmen E. coli produkující EcoRI - EcoRI zničí většinu molekul DNA fága lambda, které napadají buňky - pokud se objeví plaky - reprezentují mutované fágy, v nichž došlo k pozměnění cílových míst pro EcoRI - opakovanými cykly infekce lze získat molekuly lambda, ve kterých budou chybět všechna místa EcoRI Sbalování DNA in vitro • přenos fágové DNA do buněk transfekcí je méně účinný než infekcí (větší velikost než obvyklé plazmidy) • fágovou DNA lze účinněji přenést do buněk prostřednictvím fágových částic, které se sestaví pomocí sbalovacích extraktů, obsahujících prekurzory fágových hlav a bičíků • rekombinantní lineární molekula DNA zakončená místy cos se sbalí do fágových kapsidů • vytvořenými viriony se infikují hostitelské buňky E.coli, kde se rekombinantní DNA pomnoží Dva typy vektorů odvozených od fága Lambda • Inzerční vektory: cizorodá DNA se vkládá do 1 restrikčního místa. Maximální klonovací kapacita dosahuje cca 13 kb. • Substituční vektory: cizorodá DNA nahrazuje střední úsek genomu fágového vektoru, který je z něj restrikčními endonukleázami před vložením cizorodé DNA vyštěpen. Klonovací kapacita se pohybuje dosahuje až 23 kb. Inzerční inaktivace umožňuje odlišit rekombinantní vektor lgt10 od prázdného • místo EcoRI je umístěno v genu cI kódujícím represor • rekombinantní fág netvoří funkční represor: neschopnost lysogenie - jasné plaky • parentální fág: zakalené plaky Kmen E.coli hfl usnadňuje identifikaci rekombinantních fágů • hfl „high frequency of lysogenization“ • parentální fág navozuje lyzogenizaci s vysokou preferencí: neposkytne žádné plaky • rekombinantní fágy s nefunkčním represorem do lyzogenního stavu nevstoupí: vzniknou jasné plaky Substituční (náhradní) vektory • deriváty fága Lambda • vyšší klonovací kapacita (až 23 kb) • využívají přítomnosti sekvencí, které nejsou nezbytné pro lytický cyklus, ale jejich absence by u inzerčních vektorů znemožnila tvorbu životaschopných fágových částic (fágová hlava požaduje určitou minimální velikost DNA, ale nezáleží na nukleotidové sekvenci) • mají pro restriktázu určenou pro klonování 2 rozpoznávací místa, která lemují „nepotřebnou DNA“, tzv. „stuffer“, vycpávka Vlastnosti substitučního vektoru EMBL4 • 2 klonovací BamHI místa vymezují postradatelný fragment „stuffer“ • štěpením se uvolňuje „stuffer“+ pravé a levé rameno • ramena mají tendenci se spojovat (lepivé konce) Klonování do substitučního vektoru • štěpení vektoru enzymem BamHI • oddělení vzniklých fragmentů elektroforézou • eluce ramen z gelu • ligace ramen s klonovaným fragmentem, který má kompatibilní konce • rekombinantní fágová DNA v podobě konkatemeru je štěpena in vitro před začleněním do fágových hlaviček („DNA packaging“) • infekce „trávníkových“ bakterií, tvorba plak Výhody substitučních vektorů • preferenčně jsou klonovány větší fragmenty (pokud je fragment menší než 8 kb nejsou částice životaschopné) • defosforylace inzertu: zamezení tvorby většího počtu tandemově uspořádaných insertů • rozlišení rekombinantních a prázdných vektorů: střední fragment může kódovat b-galaktozidázu: plaky původního (nerekombinovaného) fága jsou modré na médiu obsahujícím X-gal Kosmidy • hybridy mezi fágovou DNA a bakteriálním plasmidem • plazmidy, které obsahují místo cos • spojení výhod plazmidových vektorů a vektorů odvozených od fága Lambda • využívají toho, že sbalování probíhá in vitro nejen s genomy lambda, ale také s jakoukoliv molekulou DNA nesoucí místa cos ve vzdálenosti 37-52 kb Využití kosmidů pro klonování • štěpení, ligace insertů a purifikace rekombinantních klonů se provádí stejně jako při práci s plazmidy • ligační podmínky se nastaví tak, aby byla podporována tvorba konkatemerů • místo transformace bakterií se ligační směs podrobí sbalování in vitro („DNA packaging“) • vzniknou fágové částice, které zajistí přenos rekombinantní DNA do bakterií, ale nejsou životaschopné (nedochází k tvorbě plak, v kosmidu nejsou přítomny fágové geny) • kosmid se bude v bakteriích replikovat jako plazmid Výhody kosmidů • klonovací kapacita 30 – 44 kb • možnost propagace a purifikace konvenčními metodami pro práci s plasmidy • přirozená selekce pro velké inzerty Bakteriofág M13 • vláknitý bakteriofág infikující E.coli • připojuje se na špičky povrchových výrůstků bakterií (pilusy), které nesou F-plazmid ^• neinfikuje bakterie F^- • dlouhý vláknitý tvar fágové částice • obsahuje jednořetězcovou kružnicovou molekulu DNA (6,4 kb), obsahující sekvence 10 genů • pouze jedna mezigenová sekvence o velikosti 507 nukleotidů, kam je možné klonovat Životní cyklus fága M13 Replikace DNA fága M13 • jednořetězcová DNA se uvnitř buňky mění na dvouřetězcovou DNA (replikační forma - RF) • RF se replikuje mechanismem „valivého kruhu“, jehož produktem je lineární jednořetězcová DNA • vzniklé vlákno se opět mění na RF nebo se začleňuje do dceřinných fágových virionů Tvorba částic fága M13 • při replikaci fágové DNA se v buňce hromadí mnoho kopií molekul podobných plazmidům • zároveň se exprimují fágové geny • fágový protein 5 se váže k ssDNA a zahajuje její přesun k membráně, kde dojde k sestavení dceřinných fágových částic • viriony nezpůsobují lyzi buňky (matné plaky) Výhody vektorů odvozených od M13 • replikace zahrnuje tvorbu ds DNA, kterou lze z buněk izolovat jako plazmidovou DNA a dále s ní jako s plazmidem manipulovat (použít ke klonování) • významně usnadněno získání ssDNA: do fágových virionů jsou sbalovány jednořetězcové kružnicové molekuly DNA, které lze snadno izolovat • velikost virionu vláknitého fága je určena délkou molekuly DNA: délka klonované DNA není omezena (lze klonovat fragmenty DNA, jejichž velikost dosahuje několikanásobku délky fágového genomu) • infikované buňky jsou viabilní: nevznikají plaky, ale zóny pomaleji rostoucích buněk jsou viditelné - lze získat fágy o vysokém titru Expresní vektory • upraveny nejen pro klonování DNA, ale také pro její expresi • obsahují signály pro: - iniciaci transkripce (promotor) u transkripčních fúzních vektorů - iniciaci transkripce a translace (promotor, RBS a startovní kodon) u translačních fúzních vektorů • cizorodá DNA může být přepisována in vitro 2 typy expresních vektorů 1. Transkripční fúzní vektor • obsahuje promotor • translační signály poskytuje klonovaná DNA 2. Translační fúzní vektor • obsahuje signály pro iniciaci transkripce i translace • klonovaný fragment se začleňuje do kódující oblasti genu ve vektoru • inzert musí respektovat čtecí rámec Transkripční fúzní vektor Translační fúzní vektor Expresní vektor lgt11 • inzerční vektor • obsahuje klonovací místo EcoRI uvnitř genu b-gal: inzerce fragmentu inaktivuje -galaktozidázu – bílé plaky na médiu X-gal • pokud je inzert ve správném čtecím rámci, vznikne proteinová chiméra – produkt fúze klonovaného genu a b-gal • protein je možno detekovat protilátkou Inducibilita exprese • nežádoucí exprese z neindukovaných promotorů limituje klonování, pokud je produkt klonovaného genu toxický • výhodný je promotor fága T7: není rozeznán RNA polymerázou E. coli Využití expresních vektorů Postup: • klonování fragmentu DNA do vektoru pod kontrolu promotoru T7 • přenesení plazmidu do kmene E. coli, který obsahuje gen pro T7 RNA polymerázu pod kontrolou lac promotoru • exprese T7 RNA polymerázy je inducibilní IPTG, částečná „netěsnost“ neindukovaného promotoru lac se řeší přidáním inhibitorů • T7 RNA polymeráza zajistí expresi klonovaného genu Vektory pGEM Vektory pro klonování a expresi genů v eukaryotických buňkách • primární klonování se provádí v bakteriích E. coli, následuje přenos do eukaryotických buněk • v eukaryotických buňkách se často sleduje funkce genu, interakce jeho produktu s jinými proteiny, atd. • studium možností regulace a zdokonalení syntézy důležitých metabolických produktů (např. hormonů – inzulin) • změny vlastností organizmu (např. zvýšení odolnosti užitkových rostlin k herbicidům) • větší důraz na expresi daného genu než na tvorbu genových knihoven (výjimka: vektory YAC) Kvasinkové epizomální vektory • využití: např. při výrobě léčiv z klonovaných genů • založené na přirozených kvasinkových plazmidech 2 mm, které se vyskytují u většiny kmenů S. cerevisiae • 70-200 kopií na buňku Kvasinkové epizomální vektory (YEps) - samostatná replikace v kvasinkách - obsahují místo ori pro replikaci v E.coli (kyvadlové vektory) - selekce založena na komplementaci auxotrofních mutací hostitelského kmene např. v genech trp1, ura3, leu2, his3 (podíl na biosyntéze aminokyselin) - hostitelský kmen musí nést příslušnou mutaci (kvasinka neporoste v médiu postrádajícím příslušnou aminokyselinu) - nedostatek antibiotik, ke kterým jsou kvasinky citlivé - nesou marker pro rezistenci k antibiotiku pro selekci v E.coli Kvasinkový epizomální vektor Kvasinkové epizomální vektory Klonování v kvasinkových epizomálních vektorech Kvasinkové centromerové vektory Expresní kvasinkové vektory Kvasinkový integrační plazmid (Yip) Kvasinkový integrační plazmid (Yip) Umělý kvasinkový chromozom (YAC) Klonování v YAC PAC a BAC Klonovací kapacita vektorů Klonování ve vyšších rostlinách Vektory odvozené od plazmidu Ti Agrobacterium tumefaciens Ti plazmidAgrobacterium tumefaciens Využití Ti plazmidu k přenosu genů do rostlin Využití Ti plazmidu k přenosu genů do rostlin Využití Ti plazmidu k přenosu genů do rostlin Ne všechny rostlinné buňky přijmou exogen Regenerace rostlin z transformovaných buněk Podmínka regenerace: úprava Ti plazmidu Přímý přenos genů do rostlin (biolistika) Vektory pro živočichy Vektory pro hmyz Transpozony P elementy Vektory založené na P elementech Klonování ve vektorech založených na P elementech Vektory založené na bakulovirech Vektory pro klonování u savců Vektory pro savčí buňky Vektory pro savčí buňky odvozené z plazmidů Klonovací vektory pro savčí buňky odvozené z virů Vektory odvozené od viru SV40 Klonování založené na vektorech SV40 Klonování založené na jiných virových vektorech Retrovirové vektory Retroviry Klonování do retrovirových vektorů Klonování genu bez vektoru