Analýza genové exprese Analýza genomu – genomika Analýza transkriptomu – transkriptomika Analýza proteinu - proteomika Analýza transkripce • studium množství určitého transkriptu v daném vzorku a v daném čase • studium transkripční aktivity daného genu POZOR: • množství dané molekuly mRNA v dané buňce a v daném čase závisí nejen na transkripční aktivitě, ale také stabilitě mRNA • množství mRNA nemusí korelovat s množstvím proteinu, který kóduje Northernový přenos Northernový přenos Northernový přenos - nevýhody • neposkytuje údaje o absolutním množství dané mRNA • nízká citlivost (nutnost izolace poměrně vysokých množství RNA – obvykle alespoň 1µg polyA mRNA nebo 10µg celkové RNA) Northernový přenos - výhody • nízké riziko falešných artefaktů ve srovnání s metodami založenými na PCR • umožňuje určení relativní velikosti transkriptu a existenci různých transkriptů daného genu (alternativní sestřih) Příprava protismyslové RNA Test rezistence k RNáze („RNase protection assay“) RT-PCR • amplifikace specifické mRNA • vysoká citlivost: lze detegovat specifickou mRNA v jediné buňce (výhodné pro detekci mRNA, které se v buňkách vyskytují ve velmi nízkých koncentracích) • nevýhoda konvenční RT-PCR: kvantifikace (není spolehlivá úměra mezi množstvím templátu a množstvím amplifikátu) RT-PCR RT-PCR v reálném čase • cílem je sledování množství produktu reakce od okamžiku jeho vzniku až po ukončení PCR • využití barviva, které fluoreskuje po navázání na dvouřetězcovou DNA • ve speciálním přístroji, který funguje jako termocykler a zároveň jako detektor fluorescence lze monitorovat postup PCR v reálném čase RT-PCR v reálném čase RT-PCR v reálném čase Hybridizace in situ • současné využití hybridizace a mikroskopie • hledaná sekvence RNA (nebo DNA) je imobilizována uvnitř buňky v mikroskopickém preparátu a vizualizována prostřednictvím sondy • identifikace buněk, které tvoří specifickou mRNA (nebo DNA) • identifikace buněk infikovaných viry Nevýhoda: obtížná kvantifikace Srovnání transkriptomů • identifikace genů exprimovaných v jednom organismu (tkáni) a ne v jiném • identifikace genů exprimovaných za různých podmínek • poskytuje klinicky významné informace (identifikace genů spojených s genetickými chorobami) Diferenciální skrínink genové knihovny („Differential screening“) • nejjednodušší metoda identifikace genů, které se exprimují s odlišnou účinností • příprava dvou identických kopií genové knihovny na filtrech • příprava dvou typů značených sond v podobě cDNA připravených z mRNA dvou různých vzorků • oddělená hybridizace genové knihovny se sondami • klony, které jsou pozitivní po hybridizaci s jednou, ale ne s druhou sondou, nesou odlišně exprimované geny Subtraktivní hybridizace • ze sondy jsou odstraněny společné sekvence • hledáme transkripty přítomné v jednom vzorku („tester“) a nepřítomné v druhém vzorku („driver“) Postup: • izolace mRNA z obou vzorků a příprava cDNA • cDNA „driver“ je označena biotinem • smíchání cDNA „tester“ s nadbytkem cDNA „driver“ • denaturace, renaturace • molekuly cDNA „tester“, která reprezentuje mRNA přítomné v obou vzorcích, bude tvořit hybridy s cDNA „driver“ • odstranění hybridů driver/tester a driver/driver (streptavidin) • sonda je tak obohacena o cDNA reprezentující transkripty přítomné jen ve vzorku „tester“ • skrínink genové knihovny nebo klonování a vytvoření subtraktivní knihovny cDNA Analýza reprezentativních rozdílů („Representational difference analysis“ – RDA) Princip: - vzorky cDNA nebo genomové DNA fragmentované restriktázami, které pocházejí ze srovnávaných vzorků se amplifikují PCR - po smísení, denaturaci a renaturaci se využívá toho, že hledané molekuly (přítomné v jednom a ne ve druhém vzorku) vzájemně nehybridizují Využití: - hledání genů, které zodpovídají za dědičné poruchy - hledání diferenciálně exprimovaných genů Analýza reprezentativních rozdílů („Representational difference analysis“ – RDA) • příprava cDNA vzorků „driver“ a „tester“ • ligace linkerů na konce cDNA a jejich využití pro amplifikaci PCR • odstranění linkerů • jiná dvojice linkerů se připojí k produktu PCR testeru, ale ne driveru • smísení molekul cDNA testeru a driveru (driver je v nadbytku) • denaturace, renaturace • unikátní sekvence testeru nebudou tvořit hybridy s řetězci driveru, ale jen testeru (komplexy tester/tester) • PCR budou amplifikovány pouze komplexy tester/tester • komplexy driver/driver nebudou amplifikovány (absence primerů) • komplexy tester/driver mají nespárované konce, které mohou být odstraněny nukleázou (nebudou amplifikovány) Diferenciální display • metoda srovnávající dvě populace cDNA • založena na PCR • jeden primer se váže na sekvenci poly-A • druhý primer se váže náhodně • PCR probíhá při velmi nízké připojovací teplotě • dojde k amplifikaci určité subpopulace molekul cDNA • tato subpopulace je natolik malá, že ji lze rozdělit na polyakrylamidovém gelu • stejné primery se použijí k amplifikaci DNA ze srovnávaných vzorků • metoda neusnadňuje analýzu odlišně exprimovaných genů (nutno zkoušet různé sady primerů) Metody založené na čipech Zodpovídají globálnější otázky typu: Jaké je celkové spektrum genů, které se exprimují nebo neexprimují za určitých podmínek? Microarrays – DNA čipy • základem jsou syntetické oligonukleotidy nebo produkty PCR, které odpovídají velkému počtu (nebo všem) genům daného organismu • robotem se tyto fragmenty DNA kovalentně připojí na speciální skleněnou destičku v podobě uspořádaných teček • hybridizace se značenou DNA izolovanou z daného vzorku: - genomová DNA (genomové studie) - cDNA (expresní studie) Studium transkripce reportérskými geny Běžné reportérské systémy Využití reportérských systémů • sledování aktivity transkripčních faktorů v průběhu diferenciace nebo za různých kultivačních podmínek (stabilní transfekce) • transkripčně aktivační testy (přechodná transfekce): determinace regulátorů transkripce, vazebných míst na DNA, atd. Analýza regulačních elementů v sekvenci DNA a proteinů vážoucích DNA • přesná lokalizace promotoru a dalších sekvencí DNA, které jsou zapojeny do regulace transkripce tím, že pro ně zajišťují vazebná místa • analýza interakcí DNA-protein Metody: • kvasinkový jednohybridový systém • DNaseI footprinting • gelová retardační analýza Kvasinkový jednohybridový systém Účel: • identifikace proteinů, které interagují s definovanou sekvencí DNA • lokalizace oblastí DNA, které interagují se známým transkripčním faktorem Kvasinkový jednohybridový systém Postup: • začlenění testované sekvence DNA (návnada – „bait“) v tandemových kopiích do vektoru proti proudu transkripce od reportérského genu • začlenění konstruktu do kvasinkového genomu • za nepřítomnosti transkripčního faktoru vážoucího návnadu nebude reportér exprimován • po transformaci tohoto kvasinkového kmene expresní knihovnou cDNA bude reportér aktivován v těch klonech, které exprimují příslušný transkripční faktor Využití možnosti kooperace aktivační domény a DNA vážoucí domény z různých proteinů Transkripční faktory obvykle obsahují 2 oddělitelné a nezávislé domény: • doménu zodpovědnou za vazbu na DNA • transkripčně aktivační doménu Proteinové chiméry obsahující tyto domény odvozené z různých proteinů jsou funkční: • nahrazením DNA-vážoucí domény proteinu GAL4 jinou doménou pro vazbu na DNA vzniká chiméra aktivující transkripci jiné sady genů Postup: • příprava cDNA s použitím speciálního vektoru, který kóduje aktivační doménu transkripčního faktoru GAL4 • geny začleněné do tohoto vektoru budou v transformovaných buňkách exprimovány jako proteinové chiméry s aktivační doménou GAL4 • reportér bude aktivován pokud vzniklý protein disponuje příslušnou DNA-vazebnou doménou Výhoda: • tento systém může odhalit větší množství proteinů vážoucích DNA (nejen transkripční faktory)