Získání klonovaných genů Získání klonovaných genů Získání klonovaných genů Přímá selekce Přímá selekce – „marker rescue“ Genová knihovna (genová banka) Klasifikace Podle původu DNA: • genomová knihovna - soubor klonů, který zahrnuje všechny geny daného organismu • knihovna cDNA - soubor klonů komplementární DNA (cDNA), které byly připraveny zpětnou transkripcí mRNA a v podobě cDNA tak reprezentují transkriptom daného organismu/tkáně/buňky v daném čase • knihovny cDNA připravené z různých tkání téhož organismu jsou odlišné • expresní knihovna - knihovna cDNA vytvořená expresními vektory - klonované sekvence mohou být exprimovány Genomová knihovna Příprava: • izolace celkové buněčné genomové DNA • fragmentace na části o vhodné velikosti (restrikční endonukleázy) • klonování fragmentů do vhodného vektoru • u vektorů Lambda, nebo kosmidů: ligační směs se smísí se sbalovacími extrakty • u plazmidových vektorů: ligační směs se použije k transformaci bakterií • knihovna má podobu transformovaných bakterií nebo fágových částic • identifikace klonu obsahujícího studovaný fragment Uchování knihovny • zamražení bakteriální suspenze vytvořené ze smíchaných kolonií nebo fágového lyzátu vytvořeného ze směsi plaků • knihovna je smícháním původních jednotlivých transformantů nebo fágových virionů amplifikována: každý klon je v amplifikované knihovně zastoupen v mnoha kopiích Výhody a nevýhody Knihovna cDNA: • menší velikost (neobsahuje introny, regulační sekvence, nepřepisované oblasti) • snadnější prohledávání • možnost sledování změn genové exprese souvisejících s genetickými chorobami, rakovinou, diferenciací, atd. Velikost knihovny Výpočet počtu klonů nutných pro vytvoření úplné genové knihovny • není možné zajistit, aby daná knihovna obsahovala úplnou genetickou informaci daného genomu se 100% pravděpodobností • se zvyšujícím se počtem klonů se zmenšuje pravděpodobnost, že další klon přinese novou informaci (redundance) • matematicky lze stanovit, s jakou pravděpodobností se daný gen v knihovně vyskytuje Výpočet počtu nezávislých klonů nutných pro vytvoření úplné genové knihovny N = ln(1 - P) / ln(1 - F) N = počet klonů P = pravděpodobnost, že knihovna obsahuje žádaný fragment DNA F = frakce genomu reprezentovaná průměrným klonem (podíl průměrné velikosti inzertu a celkové velikosti genomu) Ověření kvality knihovny Otázky: • jaká je proporce klonů, které obsahují inzert? • jaká je velikost klonovaných inzertů? Odpovědi: • namnožení jednotlivých klonů, extrakce plazmidové nebo fágové DNA, restrikční analýza, gelová elektroforéza • využití „modro-bílého“ testu Ověření kvality knihovny Problémy spojené s tvorbou genových knihoven • nestejná velikost fragmentů: rozdílná pravděpodobnost jejich začlenění do vektoru • omezená klonovací kapacita vektorů neumožňuje charakterizaci dostatečně dlouhých úseků DNA Procházení po chromozomu Cíl: • vyhledání klonů, které nesou překrývající a na sebe navazující inserty • uspořádáním těchto klonů lze získat informaci o spojité sekvenci v určité oblasti genomu Předpoklad: • z předchozí genetické analýzy je přibližně známa oblast genomu, v níž se hledaný gen nebo sekvence nachází • jsou k dispozici sekvence okolních oblastí, které slouží jako výchozí body pro procházení Procházení po chromozomu - postup • sondou se vyhledá klon nesoucí již dříve charakterizovaný úsek genomu • z koncových částí inzertu takto nalezeného klonu jsou připraveny sondy, kterými je genová knihovna znovu prohledána, atd. • opakováním tohoto postupu se získá informace o souvislé sekvenci, která má začátek v charakterizovaném úseku genomu a končí v oblasti vzdálené stovky kilobází „Chromosome walking“ Nevýhody techniky „procházení po chromozomu“ • Někeré úseky genomu se obtížně klonují • Některé úseky genomu jsou tvořeny repeticemi, které nelze jako sondy použít Srovnání knihoven překrývajících a nepřekrývajících se fragmentů DNA Částečné štěpení DNA („partial digest“) Přerušení DNA jen v některých z cílových míst pro daný restrikční enzym. Možné experimentální přístupy: • zkrácený reakční čas • nižší počet jednotek enzymu • snížená inkubační teplota Částečné štěpení DNA pro přípravu překrývajících se fragmentů Přeskakování po chromozomu Přeskakování po chromozomu - postup