Molekulární podstata nádorového bujení klíč k porozumění procesů v základech lidské rakoviny. Nádor vzniká ze společné buňky, ve které byl - většinou desítky let před vznikem viditelného nádoru - zahájen program neregulovaného dělení. Maligní transformace buňky probíhá přes akumulaci mutací ve specifických třídách genů. Existují dvě třídy genů, které dohromady tvoří jen malou část celé genetické výbavy, ale hrají hlavní úlohu v zahájení procesu tvorby nádoru. Ve své normální konfiguraci řídí životní cyklus buňky, tj. sled dějů, při kterých se buňka zvětšuje a dělí. PROTOONKOGENY jsou normální buněčné geny mající základní význam ve fyziologii buňky. Hraií úlohu především v regulaci životního cvklu buněk: ► Buněčného cyklu ► Buněčné proliferace ► Diferenciace ► Apoptózy V průběhu evoluce dobře konzervovány a jejich přítomnost v normálních buňkách všech vyšších organismů předpokládá, že mají základní význam v buněčné fyziologii. Kódují proteiny, které hrají klíčovou na různých úrovních integrace mitogenních signálů nesených růst. faktory a hormony. Jsou-li modifikovány, ať na strukturální nebo kontrolní úrovni, začnou se chovat jako onkogeny a podporují vývoj nádoru. ONKOGENY mutované nebo aktivované protoonkogeny Proces karcinogeneze zahrnuje změněné exprese nebo funkce protoonkogenů na různých stupních transdukce signálů. NÁDOROVÉ SUPRESOROVE GENY (ANTIONKOGENY) zabraňují abnormální buněčné proliferaci V posledních 30 letech byla objevena řada genů odpovědných za vývoj nádorů. Na porozumění maligní transformaci má zásluhu zejména široká škála dřívějších prací s onkogenními virusy. glycoprotein complex I glycoprotein complex IIT Copyright 19« ■ '97 Marko fteschke První tzv. ONKOGEN s r c (sarcoma) byl izolován v roce 1970 z viru Rousova sarkomu u kuřat. Virus Rousova sarkomu má dvě rozdílné části: část kódující proteiny odpovědné za replikaci viru a část kódující s r c gen umoňující vznik nádorů in vivo u kuřat. Normální kuřecí genom obsahuje příbuzný gen c-src. Později se ukázalo, že řada retro virů je onkogenních. Bylo též prokázáno, že src není jednoznačně retro virový gen, ale spíše téměř přesná kopie genu nalezeného ve všech kuřecích buňkách. Tento normální gen, tzv. proto-onkogen je v retro viru modifikován (aktivován) tak, že působí po přenesení do buněk nádor. Objev s onkogeny příbuzných sekvencí v eukaryotickém genomu stimuloval úsilí transformovat normální buňky DNA stejným způsobem jaký užívají retro virusy. Mnoho protoonkogenů kóduje proteiny mající vztah k růstově stimulačním signálům přecházejících z vnějšího prostředí do nitra buňky. Růst buňky je deregulovaný, jestliže mutace v protoonkogenů způsobící trvalou aktivaci růstově stimulační dráhy. Toto souvisí se signály, které si navzájem předávají buňky v tkáních. Jedny buňky uvolňují růstové faktory, proteiny (glyko), které se pohybují mezi buňkami a po vazbě na vhodný receptor na povrchu jiných buněk vyvolávají kaskádu dějů, které přenáší tento signál přes cytoplasmu až do jádra. V jádře pak proteiny nazývané transkripční faktory odpovídají tím, že aktivují řadu genů, které pomáhají buňce procházet buněčným cyklem. Podobně funguje i přenos růstově inhibičního signálu. V normální buňce je rovnováha stimulačních a inhibičních signálů pečlivě regulována, protože to souvisí s regulací buněčného cyklu, který je rozhodující pro buněčnou proliferaci a diferenciaci. V nádorové buňce je v důsledku změn v signálních drahách organizace buněčného cyklu narušena. Buňka je vybavena také zpětnovazebnými mechanismy, které mohou působit proti neobvyklým změnám v procesu bun. dělení. Apoptóza - schopnost buňky spáchat za určitých podmínek „sebevraždu", tj. jestliže její základní komponenty jsou porušeny nebo jestliže je její kontrolní systém deregulován. Tak působí např. poškození chromozomální DNA. V tomto procesu se účastní také specifické geny např. p53 nebo bcl-2. Mutace těchto genů pak způsobují poruchy apoptózy. Bylo zjištěno, že neschopnost apoptózy přispívá ke vzniku nádorů a k jejich rezistenci k terapii. Druhým obranným mechanismem proti neustálé proliferaci je vestavěný buněčný mechanismus, který sčítá a limituje celkový počet dělení buňky, buňka stárne a hyne. Molekulárním nástrojem tohoto sčítaní jsou segmenty DNA na koncích chromosomů tzv. telomery. Ty se při každém dělení zkracují a když dosáhnou kritické délky dochází k stárnutí a krizi. Jestliže tento sčítací systém funguje v nádorové buňce řádně, její nadměrná proliferace je přerušena předtím, než je nádor příliš velký. Aktivací genu, který kóduje enzym telomerázu, který není v normálních buňkách, ale byl nalezen v nádorových buňkách, však dochází k obnově telomerických segmentů a to umožňuje buňce se nekonečně množit, tj. stát se nesmrtelnou. =—GGGTTAG j ■ i ■ -GGGTTAGGGTTAG GGGTTAGGGTTAG Většinou trvá desítky let než se v prekarcinogenní populaci nasbírá dostatek mutací k malignímu růstu. U některých jedinců je však tato doba silně zkrácena. To je vysvětlováno dědičností některých genů způsobujících rakovinu. Jestliže rodičovská zárodečná buňka obsahuje mutaci tak u potomka je tato mutace přítomna ve všech buňkách těla a pravděpodobnost vzniku nádoru je vysoká. Protoonkogeny lze dělit ^ Podle lokalizace jejich produktu na ty, které kódují 1) sekreění proteiny 2) proteiny buněčného povrchu 3) cytoplasmatické proteiny 4) jaderné proteiny ^ Podle funkce jej ich produktů na 1) růstové faktory (např. sis, hst), 2) receptory pro růst. faktory (např. fms, kit, erb B), 3) cytoplasmatické proteiny - protein kinázy (např. raf) a G-proteiny (např. ras), 4) jaderné proteiny (např. myc, myb, fos, jun) Jaderné protoonkogeny jako jsou c-myc, c-fos, c-jun, c-myb - tzv. geny rané odpovědi (immediate early genes) a jejich produkty jsou proteiny vážící se na DNA a fungující jako tzv. transkripční faktory, které regulují transkripci pozdních genů. Jsou většinou aktivovány overexpresí, která může být indukována různými způsoby: translokací (Burkitt lymphoma), insercí retroviru (spíše v experimentálních systémech), amplifikace genů - to je obecný mechanismus aktivace jader, protoonkogenů a byla pozorována u řady nádorů. RUSTOVE FAKTORY - EGF, TGFoc, TGFß, IGF G - PROTEIN ras, rev — TYROSIN KINAZY / src, abl 1 I PROTEIN / Kl N AZA C / RECEPTORY PRO RŮSTOVÉ FAKTORY - EGF-R V -NEU X - PDGF-R JADERNE PROTOONKOGENY myb myc jun GENY PRO RUSTOVE FAKTORY <* Přenos signálů a růstová regulace v eukaryotických buňkách. Jsou znázorněny reprezentativní protoonkogeneny v signálních dráhách. ONKOGENY a ANTI-ONKOGENY Externí signály J. T Přenos externích signálů Růstové faktory mas Transmembranove receptory ras rap Tyrosinové kinázy GTP-vazebne proteiny Jaderné děje Serme -treoninové kinázy Rb myc ets sls m fos P53 myb Jun Replikace DNA METABOLICKÁ ODPOVĚĎ Onkogeny a anti-onkogeny: hlavní funkční skupiny onkogenních proteinů a jejich pravděpodobná vnitrobuněčná lokalizace. Anti-onkogeny jsou označeny větším písmem. Mutace protoonkogenu vedoucí k transformaci můžeme funkčně rozdělit do dvou tříd: získání funkce (gain-of-function), kde aktivita protoonkogenu vzrůstá a má za následek abnormální nebo nadměrmou růstovou stimulaci ztráta funkce floss-of-function), která vede k inaktivaci represorové složky, která normálně negativně ovlivňuje buněčnou proliferaci (nádorově supresorové geny - p53, RB, geny pro antiproliferační molekuly -TGF ß, TNFa, interferon y) V obou případech je výsledkem nadměrná stimulace růstu. (A) overactivity mutation (gain of function) single mutation event creates oncogene normal cell activating mutation enables oncogene to stimulate cell proliferation cells that proliferate abnormally (B) underactivity mutation (loss of function) second mutation / il\ mutation event event normal cell inactivates \ I inactivates *" tumor ^*J JÍ/ second gene -suppressor no effect of copy ' / | \ gene mutation in one two inactivating mutations gene copy functionally eliminate the tumor suppressor gene, stimulating cell proliferation Autokrínní signál A SINGLE SIGNALING CELL RECEIVES A WEAK AUTOCRINE SIGNAL IN A GROUP OF IDENTICAL SIGNALING CELLS, EACH CELL RECEIVES A STRONG| AUTOCRINE SIGNAL Figure 15-6. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Při buněčné transformaci a karcinogenezi se uplatňují autokrínní mechanismy (vznik autokrínní smyčky) - neplánovaná produkce růstových faktorů buňkami nesoucími odpovídající receptory nebo aberantní exprese receptoru. proto-oncogene DELETION OR POINT MUTATION IN CODING SEQUENCE DNA—^^H— RNA — hyperactive protein made in normal amounts normal protein greatly overproduced CHROMOSOME REARRANGEMENT or i nearby regulatory DNA sequence causes normal protein to be overproduced T DNA RNA fusion to actively transcribed gene greatly overproduces fusion protein; or fusion protein is hyperactive HEALTHY CELL WITH ONLY 1 NORMAL Rb GENE COPY normal Rb gene in paternal chromosome rnutatio Rb \oc in maternal chromosome ion at *■ < 3CUS^_LJ POSSIBLE WAYS OF ELIMINATING NORMAL Rb GENE n nn n Q QQ BR nondisjunction nondisjunction mitotic (chromosome and recombination loss) duplication nn gene deletion point conversion mutation Figure 23-29. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Spektrum účinků p53 v modulaci přežívání a frekvence změn genu p53 u lidských nádorů Fig, 1 The spectrum of survival-modulation effects of p53 p£1; promotes growth arrest bcl-x: blocks apoptosis gadd-45: DNA repair (?) MDM-2 C095 (?) Cyclin G (?) p21: promotes growth arrest □ax; promotes apoptosis IGF-BP3: inhibition of IGF signalling bcl-2: blocks apoptosis MDR; increases drug resistance Survival Death ^^^^ ^"^^^ \ Fig, 2 Frequency of p53 gene alterations in human cancer 1 Lung J Colon f Esophagus Ovary Pancreas Skin Stomach Head and neck Bladder Sarcoma Prostate Liver Brain Breast Kidney Blood Mefaroma Cervix Testis ■ -------------------1 rGreenbtatf et al. !994) -----------------------------------------"—_:__-- —i i ___________] i ZD -------------1 ------------1 Zl i -----------1 x 1 : 1 -------1 ~~~n ZZ2 3 -----------1-------------- 10 20 30 40 Frequency of p53 aUefations [%) 50 60 Vztahy mezi genetickými a fenotypovými změnami u nádorů Gentic alterations Phenotypic alterations ________w Proliferation Differentiation ApOptOSiS Response to genetic damage Oncogene Tumor suppressor gene ^••*». ** Invasion 1 Metastasis Onkogeny a nádorově supresorove geny mají funkce v regulaci proliferace, diferenciace, apoptózy a odpovědi na genetické poškození. Jejich úloha v invazi a vzniku metastáz je však nejasná. NORMÁLNI, KONTROLOVANÝ RŮST GAP JUNCTION Ztráta nádorově supr. genů INICIACE ABNORMÁLNÍ RŮST, ale stále ještě nějak kontrolovaný adorove su geny Aktivované okogeny ++ GAP JUNCTION nebo Aktivace více onkogenů Nádorově suW. geny \ Aktivované ^í"++ onkogeny Nefunkční mezibuněčná NEKONTROLOVANÝ RUST komunikace NEKONTROLOVANÝ RUST Poznatky o molekulárně genetické podstatě nádorového onemocnění lze shrnout takto: ► primární pro vznik nádoru jsou změny vyvolané jak genetickými (mutace v DNA) tak negenetickými příčinami (ovlivnění exprese genů) ► karcinogeneze je několikastupňový proces založený na poruše genetické homeostázy a pouze dílčí změna v kterémkoliv článku ke vzniku nádoru nevede ► ke vzniku nádoru může vést jen kombinace poruchy několika různých mechanismů, přičemž cesty, kterými se tak děje mohou být velmi rozdílné ► byly nalezeny velké individuální a mezidruhové rozdíly i tkáňová a orgánová specifita ve spojitosti se vznikem nádorů ► na vzniku nádoru se mohou významně podílet látky z vnějšího prostředí ZMENY METYLACE DNA A ACETYLACE HISTONU NÁDOROVÁ EPIGENETIKA EPIGENETIKA - dědičné změny v genové expresi beze změn v sekvenci DNA Epigenetické změny hrají významnou úlohu v karcinogenezi. Savčí buňky mají schopnost epigeneticky modifikovat svůj genom prostřednictvím ► METYLACE DNA, tj. kovalentního přidávání metylových skupin do 5 pozice na cytosinovém kruhu v CpG dinukleotidu s účastí enzymu metyltranferázy. Přibližně 70% CpG zbytků v savčím genomuje mety lo váno, distribuce je nerovnoměrná, většina genomuje chudá na CpG. Metylace DNA hraj e zásadní úlohu v normálním vývoji, v inaktivaci chromozómu X a supresi tzv. parazitických sekvencí DNA. Umožňuje „zapínat a vypínat" geny na správném místě a ve správné době. Aberantní metylace DNA v promotorové oblasti je však také klíčovým mechanismem inaktivace nádorově supresorových genů. Může způsobit zvýšení mutací a dědičně tlumí geny, jejichž promotory jsou asociovány s tzv. CpG „islands" a které kontrolují buněčnou proliferaci. Zatím neznámé mechanizmy zabraňují de novo metylaci těchto promotorů u normálních buněk. Důkazy spojitosti mezi metylaci DNA a genovou expresí s využitím inhibitoru metylace - 5- azacytidinu (5-AZA)- mnoho genů může být reaktivováno. Hypo- nebo hypermetylace DNA (obsah 5-metylcytosinu) patří mezi negenotoxické mechanismy karcinogeneze. Metylaění struktura v nádorových buňkách se liší od normálních buněk. Globální hypometylace genomu je doprovázena místně specifickou hypermetalací. Hypermetylace promotorů pro nádorově supresorové geny v CpG islands je doprovázena jejich utlumením a růstovou výhodou pro tyto buňky. Hypometylace DNA je spojena se zvýšenou genovou expresí. Metylace DNA může též usnadňovat mutagenezi (5MeC může spontánně deaminovat na tymin - hypermutabilita). ► ACETYLACE HISTONŮ Genová exprese je regulována i strukturou chromatinu. Chromatin obsahující hypoacetylované lysiny v histonech má kompaktní strukturu represivní pro transkripci. Inhibitory histonových deacetyláz (HDAC) mohou vytvářet otevřené struktury chromatinu a aktivovat určité geny inhibující nádorový růst využití v terapii (butyrát, trichostatin). Existuje „crosstalk" mezi metylací DNA a acetylací histonů při tlumení (silencing) genové exprese. 5 AZA a HD AC inhibitory v kombinaci způsobují reaktivaci nádorově supresorových genů Unmethylated CpG Island Activators» Histone Acetyltransferases, Basal Transcriptional Machinery Protect the Island r tirf m o> It í i RNA Transcription Hypermethylated CpG Island Transcriptional Repressors, Histone Deacetylases, DNA Methyltransferases and Methyl-binding Proteins Shut-Down the Island ,—a—, Spreading from Methylation Centers, Seeding of Methylation, Selective Advantage... v mi i c a i i Transcription is Abolished LJ Figure 1 The typical CpG island of a tumor suppressor gene is represented in a normal and a tumor cell, The presence of a dense hypermethvlation changes completely its molecular environment, White dots, unmethylated CpGs; Black dots, methylated CpGs Utlumení genové exprese aberantní metylací DNA a modifikací histonů CoR 3 HPAC V MeCP2N CH3 DNA methylation histone deacetylation H-3 Lys-9 methylation CH3 CH3 DNA demethyiation historie acetylation H-3 Lys-4 methylation CH3AC CH3 Ac Nukleosomy v promotorové oblasti. Proteiny vážící se k 5MeC (MeCP2) se váží k metylovaným CpG místům a způsobují tlumení genové exprese histon deacetylázou (HDAC). Přítomnost tohoto komplexu, deacetylace lysinu v histonech a metylace histon-3 lysin-9 histon metyltransferázou přeměňuje nukleosom v kompaktní konfiguraci, která zabraňuje vazbě transkripčních faktorů. Demetylace a deacetylace způsobuje pak zase uvolnění inhibičního proteinového komplexu a tvorbu otevřené struktury nukleosomu, která umožňuje transkripci. 30 25 20 15 10 5 0 Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancer According to the Tumor Type Yl------------------ I n ni ' , rji III \ I H ŕ=B j^-a _ - 1 | : U LU LU L > i 1 í 1 [ j re=i llillSQlooo 2 3 4 S 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 I .Lymphoma 2*Esophagus 3 .Stomach 4 »Colon 5,Pancreajs Č.Leukamia 7-Utcrus S.Liver 9 Head & Neck lO.Gtioma lLKirfncy 12,Breasť 13. Lung 14*Ovary lS.BIadder Percentage of CpG Island Hypermethylation in Human Cancers According to the Tumor Suppressor Gene pl6ENK4, pl5INK4b »A PK hMLHl MGMT 6-APC 7.GSTP1 8.p73 9. pl4ARř 10, BRCA1 8 10 Figure 3 (a and b} are alternative ways to present our CpG island hypermethylation profile of human cancer (Eßteller et aľ. 2001a). O. ĽL immortalization crisis p53-minus TPA senescence Time in Culture Normal cells divide a limited number of times before permanently exiting the cell cycle and remaining in a viable non-proliferative state referred to as senescence (1). If p53 is inactivated in these cells, the cells may resume dividing a limited number of times, before they permanently exit the cell cycle (p53-minus TPA) (38,39). If p53 and the pRb/pl6INK4a pathway are both disrupted, for example, by the presence of SV40 or HPV viral oncoproteins, the cells may bypass senescence but subsequently arrest in a state referred to as crisis (44). A rare cell (~1 in 107) may escape from crisis and become immortalized. Transduction of some normal cells with hTERT expression constructs may result in expression of telomerase and bypass of senescence. Zkracování telomer může vést k chromosomální nestabilitě a vzniku nádoru SELF-RENEWAL OF EPITHELIAL CELL POPULATION BY REPEATED CELL DIVISION -----------------telomeres shorten and uncap J--------------------- normaí p53 and ceil cycle checkpoint control + normal senescent cells stop dividing _ i loss of p53 and cell cycle checkpoint control 4 mutant cell survives and proliferates! chromosome fusion CHROMOSOME BREAKAGE- FUSION-BRIDGE CYCLE chromosome translocati chromosome bridge cell dies dueto | catastrophic genomic instability and DNA damage chromosome breakage massive chromosomal damage telomerase reactivated chromosomes are partially stabilized and cell survives with many mutations + CANCER JFigure 23-36. Molecular Biology of the Cell, 4th Edition. Imortalizace je nutná,ale ne dostačující pro maligní transformaci Normal cells SV4Q-transduced mortal cells |SV4G-irnmortalized cells ras ras v^ ras V_ No transfo/nnaüonl Mo transformation! Malignant transformation! B ras Normal cells v. ME< v_p,Die—/ immortalized cells ras *MEK Pnemaiure Malignant transformation! A) In a number of in vitro models it has been shown that oncogenes, such as activated ras, can cause malignant transformation of immortalized cells but not their normal mortal counterparts. In the example illustrated, activated ras caused malignant transformation of SV40-immortalized fibroblasts, but not normal fibroblasts nor SV40-transduced fibroblasts that had not become immortalized (67). (B) Mouse fibroblasts transduced with activated ras obtain a constitutively active MEK signaling pathway. In immortalized cells this may result in malignant transformation, but in normal cells this results in upregulation of p53 and p16INK4a and premature senescence (74). Adenovirová terapie využívající promotoru pro telomerazu essential adenoviral gene product normal cell viral agent hTERT adenovirus • / \ telomerase" cancer cell telomerase- viral replication blocked viral replication • i á cell destruction viral release virus spread telomerase inhibitor alone « » tumor size telomere 'IJUMHUJI UMÍ length (kbp) 7 6 conventional therapies alone m tumor size ^O telomere length (kbp) 7 • v$£ßP wimimB ümhmb m m UHk ■■■■ ľltlWWTO 7 7 7 conventional therapies + telomerase inhibitor « « tumor size telomere OillUMi length (kbp) 7 — U 5 Si 'QUMNHD opoptooio + time of treatment