edmět: GENOTOXICITA A KARCINOGENEZE SYLABUS 1 VZNIK A ROZVOJ NÁDOROVÉHO ONEMOCNĚNI Genetické (genotoxické) a epigenetické (negenotoxické) aspekty vzniku a rozvoje nádorů Fáze karcinogeneze Iniciační, podpůrná (promoční) a progresivní fáze, genetické a epigenetické faktory, karcinogény a kokarcinogeny, antikarcinogeny Typy nádorů Nádory spontánní a indukované (onkogenní viry, chemické a fyzikální karcinogény), nádory benigní a maligní, invaze, metastázy, klasifikace podle tkání. Molekulární základy vzniku a rozvoje nádorového onemocnění Genetické mechanismy Mutace a mutageny, nádorově promoční faktory (exogénni a endogenní) Protoonkogeny, onkogeny, nádorově supresorové geny Transformace buněk Denzitně závislá inhibice růstu (kontaktní inhibice), odlišnosti normálních a transformovaných buněk, změny závislosti na pozitivních a negativních růstových faktorech, maligní transformace Imortalizace Význam telomer, telomerázy a dalších faktorů Negenotoxické (epigenetické) mechanismy Metylace DNA, acetylace histonů, změny exprese genů Změny v regulaci proliferace, diferenciace a apoptózy Změny v mechanismech přenosu (transdukce) signálů Antiproliferační molekuly - jejich vztah k růstovým faktorům, receptorům a dalším součástem kaskády přenosu signálů. Úloha buněčného cyklu a jeho změny v karcinogenezi Rovnováha v buněčných populacích Poruchy proliferace, diferenciace a apoptózy (apoptóza a nekróza) Patologické účinky cytokinu parakrinní a autokrinní regulace, poruchy pozitivních a negativních regulátorů, důsledky. Význam oxidativního metabolismu rovnováha oxido-redukčních dějů, aktivační a deaktivační enzymy, pro- a antioxidační systémy, oxidatívni stres Úloha oxidačních procesů v apoptóze Komunikace buněk Mimobuněčná, mezibuněčná a vnitrobuněčná komunikace, úloha mezero vitých spojení tzv. "gap junctions" (GJIC) v udržování tkáňové homeostázy, poruchy mezibuněčné komunikace u nádorových buněk, snižování počtu gap junctions, klonální množení iniciované buňky. Změny membránových vlastností, rozpoznávání a komunikace buněk, kadheriny, kateniny, integriny, konexiny. Metastázy Příčiny vzniku, metastatická kaskáda, kontakt buňka-buňka, buňka - mimobuněčná matrix, změny adhezivních molekul a vnitrobuněčného signálování, imunitní systém Angiogeneze Význam, induktory a inhibitory angiogeneze Vznik a rozvoj specifických typů nádorů (jejich genetické a epigenetické příčiny) Poruchy krvetvorby - leukémie Chronická myeloidní 1., myelodysplastický syndrom, akutní L, genetické poruchy, rozpojení procesu proliferace a diferenciace, poruchy apoptózy Nejčastější typy nádorů - kolorektální karcinomy, nádory prsu, prostaty, kůže Genetické a negenetické příčiny, prekancerózní stavy, etiologie, rozvoj, vnější faktory Endogenní karcinogeneze, hormonálně závislé nádory Přirozenéprotinádorové obranné mechanismy Úloha imunitního sytému, cytostatické a cytotoxické účinky monocytů a makrofágů, působení cytokinů a eikosanoidů FAKTORY VNEJSIHO PROSTREDÍ V PROCESU KARCINOGENEZE Záření - neionizující a ionizující Chemické karcinogény - polycyklické aromatické uhlovodíky (PAH), halogenované aromatické uhlovodíky (PCB, PCDD), peroxisomové proliferátory, xenobiotické lipidy, chlorované pesticidy, atd. Onkogenní viry a bakterie Důsledky působení škodlivých faktorů vnějšího prostředí Genotoxické vs. negenotoxické účinky (epigenetická toxicita) - charakteristika Poruchy homeostázy - modulace buněčné proliferace, diferenciace a apoptózy - příčiny a důsledky, vztah ke karcinogenezi Mechanismy - změny v reparaci DNA, specifické vnitrobuněčné receptory, působení reaktivních forem kyslíku -oxidatívni stres, inhibice GJIC, ovlivnění mechanismů transdukce signálu, změny metylace DNA, ovlivnění exprese onkogenů a nádorově supresorových genů Nutriční aspekty karcinogeneze Karcinogény v potravě, promoční a antipromoční působení složek potravy (vitamíny, antioxidanty) Obsah a složení tuků v potravě, polynenasycené mastné kyseliny (n-6 a n-3 mastné kyseliny) a jejich metabolity jako mediátory a modulátory buněčných signálů, mechanismy působení, oxidatívni metabolismus, lipidová peroxidace, imunitní systém, úloha eikosanoidů v karcinogenezi - interakce s cytokiny Vláknina - mastné kyseliny s skrátkým řetězcem - butyrát Současny systém detekce karcinogenních účinků látek Genotoxicita (mutagenní účinky) - testy mutagenity Problémy detekce negenotoxicky působících karcinogénu. Dlouhodobé testy na laboratorních zvířatech, krátkodobé testy - testy buněčné transformace, změny proliferace a apoptózy v tkáních, změny GJIC, detekce specifických biomarkerů (aktivity specif. buněčných enzymů a receptoru). Modely karcinogeneze - studium iniciačního a promočního působení látek - kůže, játra, ledviny, moč. měchýř, čichové orgány Příčiny rozdílné citlivosti (organismů, tkání a buněk) k působení karcinogenních látek Odhady rizik - otázky dávek, prahové hodnoty, křivky dávka-odpověď, působení směsí látek (aditivita, synergismus, antagonismus Význam experimentálníekotoxikologie - perspektivy, propojení s experimentální a prediktivní onkologií r PREVENCE, DIAGNOSTIKA A LECBA NÁDOROVÝCH ONEMOCNENÍ Experimentálni, epidemiologické a klinické studie, populační screening Genetická predispozice, životní styl Terapie - chirurgie, záření, chemoterapie, imunoterapie Prediktivní onkológie Typizace nádorů, diagnostické markery, prognostické vs. prediktivní faktory Detekce specifických parametrů - cytokinetické parametry, molekulární a jiné markery Moderní metody (průtoková a vysokorozlišovací cytometrie, laser scanning, molekulární a další metody, microarrays), stanovení proliferační aktivity, detekce apoptózy Srovnání metod a interpretace naměřených parametrů Data managment - význam vícerozměrných matematických analýz, prediktivní markery J Doporučená literatura B. Alberts et al.: Molecular Biology of the Cell, 4rd edition, Garland Science, New York 2002 B. Alberts et al.: české vydání - Základy buněčné biologie, Espero Publishing, Ustí n./Labem 1998 U.R. Folsch, K. Kochsiek, R.F. Schmidt: Patologická fyziologie, GRADA Publishing, Praha 2003 Z. Adam, J. Vorlíček, J. Koptíková: Obecná onkológie a podpůrná léčba, GRADA Publishing, Praha 2003 P. Klener: Klinická onkológie, Nakladatelství Galén a Karolinum UK Praha, 2002 J. Krejsek, O. Kopecký: Klinická imunologie, NUCLEUS HK, 2004 Z. Adam, J. Vorlíček, J. Vaniček a kol.: Diagnostické a léčebné postupy u maligních chorob, 2. vydání, GRADA Publishing, Praha 2004 A. Rejthar, B. Vojtěšek: Obecná patologie nádorového růstu, GRADA Publishing, s. r. o., 2002 S. Štípek a kol.: Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a v nemoci, GRADA Publishing, s.r.o. 2000 V. Hořejší, J. Bartúňková: Základy imunologie, 2. vydání, Triton, Praha 2002 D. Heber et al., Nutritional Oncology, Elsevier Inc., 2006 Carcinogenesis, Vol. 21, 2000 - celé číslo J. Hofmanová, A. Kozubík: Apoptóza a nádorová onemocnění - Přehled, Klinická onkológie 8, 5, 1995. A.Kozubík, J. Hofmanová: Význam nenasycených mastných kyselin v rozvoji a chemoprofylaxi nádorů kolorekta - Přehled, Klinická onkológie 1999 J. Hofmanová, M. Machala, A. Kozubík: Epigenetic mechanisms of carcinogenic effects of xenobiotics and in vitro methods of their detection. Review. Folia Biologica (Prague) 46, 165-173, 2000. Doporučené speciální separáty r RAKOVINA nej rozšírenejší epiteliální nádory řecky - karkinos -rak onkos (krab) cancer (angl.) der Krebs (něm.) - karcinomy ONKOLÓGIE - věda o nádorech Onkologická onemocnění - nádorová onemocnění KARCINOGENEZE (kancerogeneze, onkogeneze, tumorigeneze) vznik a rozvoj nádorového onemocnění Pojem „rakovina" odpovídá více než sto formám této choroby. Téměř všechny tkáně v těle mohou podlehnout malignitě. Asi 30 trilionů buněk v normálním zdravém organismu žije ve složitém vzájemně propojeném svazku, regulujíc vzájemně svou proliferaci. Vzájemná spolupráce buněk zajišťuje, že každá tkáň těla udržuje svou velikost a architekturu . Nádorové buňky naopak ničí toto schéma, stávají se hluchými k obvyklé kontrole proliferace a vytvářejí si svůj vlastní vnitřní program reprodukce. Kromě toho mají ještě nebezpečnější vlastnost - schopnost migrovat a tvořit masu ve vzdálených částech těla. Nádory z takovýchto buněk se stávají čím dál agresivnější a stávají se letální, jestliže rozrušují tkáně a orgány důležité pro přežití organismu jako celku. Nádory vznikají z naší vlastní tkáně. Teorie „nádorové kmenové buňky" - nádor je obecně odvozen od jedné buňky která se dramaticky mění po sérii genetických změn. Zdravá buňka má definovaný tvar a strukturu a prosperuje mezi uspořádanými okolními buňkami. Odpovídá na podněty ze svého okolí a dává vznik dceřinným buňkám jen tehdy, jestliže rovnováha stimulačních a inhibičních signálů z okolí upřednostní buněčné dělení. Avšak v procesu replikace nebo dělení existuje stálá hrozba vzniku mutací, náhodných změn, které mohou tento regulační cyklus porušovat. Jedna mutace může způsobit, že buňka, která vypadá normálně a je méně citlivá na vnější signály se může příležitostně začít nekontrolované dělit. Akumulace genetických změn může způsobit, že se dceřinná buňka stane zcela hluchou k externím signálům a vykazuje znaky malignity. Buňka ztrácí přesný tvar a hranice, nereaguje na růstově inhibiční signály a získává schopnost nekontrolované se dělit. Vznikající masa stlačuje a poškozuje zdravou tkáň ve svém sousedství a může dále překonávat bariéry jednotlivých orgánů a metastázovat, což znamená, že kolonizuje vzdálené tkáně. MUTACE - dědičná genetická změna v buňce (vzniká bodovou mutací, delecí nebo inzercí jednoho či více nukleotidů, amplifikací segmentů DNA, inverzí nebo získáním či ztrátou chromozomu, translokací). Základem je změna genetického materiálu v buňce nikoli změna v jeho expresi. EPIGENETICKA ZMENA - je změna v genové expresi beze změny v sekvenci DNA nebo genetickém obsahu buňky - může být dědičná INICIOVANÁ BUŇKA, TRANSFORMOVANÁ BUŇKA - buňka se změněnou genetickou informací. Vzniká spontánně neboje indukována viry, chem. látkami nebo fyzikálními faktory. Má potenciální schopnost stát se nádorovou nebo maligní. BENIGNÍ NÁDOR - je lokální rozrůstání iniciované buňky. MALIGNÍ NÁDOR - nádor se schopností vrůstat do tkání a rozšiřovat se do vzdálených míst. MALIGNÍ TRANSFORMACE - přeměna buňky s normálními růstovými vlastnostmi na buňku maligní ztrácející schopnost adekvátně reagovat a odpovídat na růstové signály. Ztráta kontaktní inhibice růstu. Porušení negativní zpětné vazby. Snížená schopnost komunikace pomocí mezibuněčných spojení -gap junctions. Termín NEOPLASIE (nový růst) se používá pro celý rozsah benigního i maligního chování buněk. ZÁKLADNI KLASIFIKACE NÁDORU Výchozí tkáň Zralé benigní buňky (nezhoubné) Nezralé maligní buňky (zhoubné) KRVETVORNÁ LYMFATICKÁ leukémie lymfom, myelom Deriferní sanslioneurom juj Icľrr pargangliom RODEC Vznik nádoru je vícestupňovitý proces, který je výsledkem složité interakce genetických a negeneticky působících faktoru 1) Indukce mutací - fáze iniciace 2) Preferovaný klonální růst iniciovaných preneoplastických buněk - fáze podpůrná - promoční - karcinom in situ 3) Fáze konverze či transformace - změna fenotypu, vznik maligního klonu 4) Fáze progrese - lokální rozrůstání nádoru, neschopnost odpovídat na regulační mechanismy vzrůstající rychlost proliferace 5) Invazi vita - šíření nádoru mimo prvotní ložisko - vznik metastáz Onemocnění vzniká v zásadě porušením homeostázy na úrovni buněk a buněčných populací r INICIACE (initiation) změna genetického materiálu buňky - mutace ireverzibilné mění normální buňku v preneoplastickou PROMOČNÍ STADIUM (promotion) indukce proliferace (klonální množení) iniciované buňky po působení tzv. nádorově promočních podnětů (regenerace po odstranění části buněčné populace nebo po smrti buněk, růstové signály, působení vnějších signálů - chem. a a fyz. faktorů) zpočátku reverzibilní, později ireverzibilní - přechod do maligní transformace PROGRESE (progression) akumulace dalších mutací + působení promočních faktorů, ztráta regulačních mechanismů invazivita a vznik metastáz ZÁKLADNÍ ZNAKY NÁDOROVÉ POPULACE ztráta kontaktní inhibice a kontroly růstu ztráta schopnosti terminálni diferenciace ztráta schopnosti apoptózy snížení nebo inhibice mezibuněčné komunikace J Ztráta kontaktní inhibice v buněčné kultuře contact-ínhibitedl monolayer of normal cells growth medium plastic tissue-culture dish multilayer of uninhibited cancer cells Figure 23-25. Molecular Bioiogy of the Cell, 4th Edition. r INICIACE PROMOCE MUTAGENY RADIACE NEGENOTOXICKE GENOTOXICKE Mnohostupňový proces karcinogeneze INICIACE kokarcinogeny exog., endog. (hormony) AKTIVACE VAZBA NA DNA KARCINOGÉN PROKARCINOGEN DETOXIFIKACE antikarcinogeny (selen, antioxidanty, složky potravy, vit. A, C, B) REPARACE DNA NORMÁLNÍ DNA NENÍ REPARACE MUTOVANÁ DNA V REPRIMOVANÉM STADIU PROMOCE MUTOVANÁ DNA V REPRIMOVANÉM STADIU DEREPRESE PROMOTORY POKRAČUJÍCÍ REPRESE KARCINOGENEZE NORMÁLNÍ STAV NÁDOR PROMOTORY NEVZNIKÁ NÁDOR ANTIPROMOTORY ANTIPROMOTORY r je udržována integrovaným systémem komunikačních mechanismů (mimo vnitro- a mezibuněčných) a reguluje chování buněk především s ohledem na schopnost proliferace, diferenciace, adaptivní odpovědi a apoptózy. Iniciované preneoplastické buňky jsou udržovány v latentním stavu v důsledku působení těchto "přirozených" regulačních mechanismů. V podpůrné (promoční) fázi rozvoje nádorů se uplatňují látky působící negenotoxickými (nebo epigenetickými) mechanismy, tzv nádorové promotory, které způsobují změny chování buněk v důsledku deregulace zmíněných procesů. Zásahy, které vedou ke změnám v expresi genů a k poruchám homeostázy se odehrávají v buňce na různých úrovních a různými mechanismy. J Způsoby promoce iniciované buňky DNA-DAMAOINQ AGENT MUTATED GENE . INITIATION] (IrwtnlbUj MlZSSSL. ,!HVSrCAL NECROSIS GROWTH EXOGENOUS MEPATECTOMY IRRITATION DUE TO VIRAL, STIMULUS PROMOTERS RADIATION OR " CHEMICAL TREATMENT • V*-^-m-U._J DEREPRESSION OF GENES I (REVERSIBLE) ■ [ PROMOTION] REPRESSION OF GENES ' w • ■ w L 4 ADDITIONAL O EN E OR CHROMOSOMAL MUTATION (IRREVERSIBLE) AUTONOMOUS TUMOR FIG. 1. Multiple modes by which initiated cells can be promoted. The concept of promotion is shown as a process that allows cells with a specific carcinogen-induced mutation to multiply, enabling them either to reach a "critical mass" and become resistant to the antiproliferative influences of normal cells or to increase the chance that one of these mutated cells would accumulate a second mutation. [From Ref (93) with permission from Churchill Livingstone Medical Journal] BIOLOGICKÉ CHARAKTERISTIKY STADII KARCINOG INICIACE Genotoxický děj (mutace) Změna v genetickém materiálu (nukleotidy, chromozómy) Ireverzibilní změna Vznik preneoplastické buňky Vykazuje dávkově závislé vlastnosti Možný "spontánní vznik iniciované buňky" Je nutné buněčné dělení pro "fixaci" mutace Při dávkové závislosti neexistuje práh PROMOCE Negenotoxické (epigenetické) děje Změny v genové expresi Reverzibilní změny Selektivní klonální expanze preneoplastické bun. populace Závislá na konstatní expozici látkou s promočními účinky Vykazuje dávkově závislé vlastnosti Je zjevný práh PROGRESE Genotoxické i negenotoxické děje Změny karyotypu a genetická nestabilita Ireverzibilní změna Tvorba neoplastických útvarů (adenomy a karcinomy) Změny podporující přechod preneoplastických buněk v neoplastické Autonomie nádorové populace Vznik metastáz r MUTACE definována jako kvalitativní nebo kvantitativní změna v genetické informaci obsažené v DNA. Je považována za ireverzibilní změnu a může být indukována viry, fyzikálními nebo chemickými faktory. Mutace mohou vznikat na úrovni genů nebo chromozómů. Jeden specifický gen může být změněn přidáním, ztrátou nebo záměnou jedné baze. Protein kódovaný tímto genem pak může být změněn s ohledem na strukturu a funkci. Jestliže mutace zahrnuje změnu v počtu chromozómů v buňce (nondisjunkce, polyploidizace), tak potom, i když jednotlivé geny jsou normální, jejich počet může narušit jejich funkci. Změny v uspořádání chromozómů způsobené delecí nebo translokací části jiných chromozómů také mohou způsobit jak mutace genů tak abnormální expresi genů umístěných na takovémto chromozómu. Dědičné mutace (Xeroderma pigmentosum, Wilmsův tumor, albinismus atd.) mohou předurčovat jedince k určitým typům nádorů. Fyzikální a chemické faktory, které působí jako mutageny též přispívají k nádorovému procesu jako iniciátory nebo progresory. j Genetické změny a disorganizace chromosomů v nádorových buňkách normal cells DNA chromosome gene A gene B tumorals O ♦ronclripatinn Geny se dědí v odpovídajících párech Mateřský a otcovský chromozóm nesou každý jednu normální kopii příslušného genu Aktivační mutace - mutovaný gen produkuje protein aktivující bun. proliferaci, stačí mutace v jedné kopii genu, dominantní Inaktivační mutace - mutovaný gen neprodukuje protein zastavující bun. proliferaci nebo produkuje jeho inaktivní formu. K mutaci musí dojít u obou kopií genu, recesívní MATERNAL CHROMOSOME Cell proliferates excessively Cell proliferates excessively GENES ARE INHERITED IN MATCHING PAIRS—one from the mother and one from the father (top). Sometimes mutation of a single copy pushes a cell toward cancer (left)—such as when it leads to production of a protein that activates excessive cell division. (Oncogenic mutations fall into that category.) Other times both copies must be altered—such as when a gene coding for a protein that stalls cell division is inactivated (right). If only one copy of such a gene is affected (a), the other copy can still generate the needed protein. But if both copies are hobbled (b), an important brake on tumor development is lost. Vznik nádorové buňky - klonální evoluce NORMAL EMERGENCE OF A CANCER CELL from a normal one (tan) is thought to occur through a Normální buňka process known as clonal evolution First, one daughter cell (pink) inherits or acquires a cancer-promoting mutation and passes the defect to its progeny and all future generations. At some point, one of the descendants (red) acquires a second mutation, and a later descendant (green) acquires a third, and so on. Eventually, some cell (purple) accumulates enough mutations to cross the threshold to cancer. 1 mutace Buňka vypadá normálně, ale je predisponována k nepřiměřené proliferaci first mutation Cell seems normal but is predisposed to proliferate excessively 2 mutace Buňka začíná příliš proliferovat, ale jinak je normální tsr-^i,* Cell begins to proliferate too much second mutation but js 0fherwise normal 3 mutace Buňka proliferuje rychleji a dochází i ke strukturálním změnám third mutation Cell proliferates more rapidly; it also undergoes structural changes Maligní buňka MALIGNANT CELL Buňka nekontrolovane roste a vypadá evidentně porušená cni idtu no Ce" 9rows uncontrollably Íatco MMTA-rmu and looks Obviously later mutation deranged 4 a další mutace Normální frekvence mutací 10~7-10~8 /nukleotid/bun. dělení. Zvýšená frekvence mutací podporuje karcinogenezi. Mutace jsou nejen znakem nádorů, ale jsou také zásadní pro jejich vývoj. Genom nádorových buněk je nestabilní a tato nestabilita vyúsťuje v kaskádu mutací, z nichž některé umožňují nádorovým buňkám obejít regulační procesy, které kontrolují lokalizaci buňky, její dělení, adaptaci a smrt. Genetická nestabilita je manifestována velkou heterogenitou buněk v každém nádoru. Dva hlavní mechanizmy vzniku mutací v nádorových buňkách: ► deficit v reparaci DNA (kopírování nereparovaných poškození v DNA nebo chyby během syntézy DNA) ► deficit v rozdělování chromozómů při buněčném dělení V buněčné DNA dochází ke stálému poškozování (environmentálními i endogenními zdroji) a k resyntéze. Mnoho z takto působících látek jsou mutageny a řada z nich i karcinogény. Poškození DNA chemikáliemi spadá do dvou kategorií: ► rozsáhlé adukty reparované excisí (vystřihnutím) nukleotidů ► malé změny vznikající např. po alkylačních činidlech, která přidávají metyl- a etylskupiny do nukleotidů, a ty jsou pak reparovány excisní reparací bazí. Další zdroje poškození DNA: ►přírodní látky v potravě ► buněčné metabolické procesy (reaktivní kyslíkové produkty-ROS) Vzhledem k vysoké frekvenci poškození je pravděpodobné, že významná část poškození unikne reparaci a produkuje mutace během replikace této nereparované DNA polymerázami. Mutace mohou vznikat též chybnou inkorporací nukleotidů DNA polymerázami při kopírování nepoškozeného templátu DNA, během replikace nebo reparační syntézy. Nukleotidové sekvence v buněčné DNA jsou udržovány v homeostatické rovnováze, kdy vzrůst poškození DNA nebo snížení reparace vedou ke zvýšené frekvenci mutací. Faktory vedoucí k akumulaci mutací v nádorových buňkách Mutace vznikají poškozením DNA a poruchami v reparačních mechanismech, čímž je narušena dynamická rovnováha mezi poškozením a reparací DNA. Mutagenesis Homeostasis I Průmyslové chemikálie Přírodní karcinogény llndustriaf Naturel C he mí ca! Carcino ge ns Endogenní zdroje Endogenous Source 1-Se- Deputation Rad|ca|B —I Polymerase Errors DNA Repair Nereparovaná poškození DNA Unrepaired DNA Damage Chybně inkorporované nukleotidy MisincorpqratBd Nucleotides MUTACE / Mutations How genetic mutations evolve into genomic instability phenctypes and cancer Celt-cyde arrest and apo ptosis Other non-neoplasia genetic diseases Clonal selection Genetic Instability (NIN, MIN) Chromosome Instability (CIN) Altered chromosome structure and numbers, continuous karyotype change Cause of genetic change : Stress factors and genoloxic insults: UV, radiation, ROS, Free Radicals, Viruses. Bacteria, excessive hormone exposure, growth signals Spojení genotoxického stresu a genomové nestability. Díky genetické nestabilitě dochází během času k akumulaci mutací buď v gametách nebo somatických buňkách. Somatické nebo dědičné genetické změny zahrnuté v genetické nestabilitě postihují funkce jako je reparace DNA a kontrolní body bun. cyklu a mitózy, což předchází zvýšenou telomerázovou aktivitu. Somatické buňky však vyžadují pro rozvoj nádoru ještě dysfunkci tzv. gatekeeper. Mutace umožňující genomovou nestabilitu jsou v gametách i somatických buňkách selektovány Ke genetické nestabilitě přispívají dva překrývající se mechanizmy : ► nádorové buňky vykazují mutovaný fenotyp založený na vzrůstajícím počtu chyb v syntéze DNA během replikace. Tyto chyby vznikají v důsledků mutací - v DNA polymerázách, takže vnášejí chyby - v DNA reparačních proteinech, které jsou potom defektní ► akumulace mutací založená na postupných vlnách klonální selekce. Buněčný cyklus a apoptóza V průběhu buněčného cyklu existuje několik kontrolních bodů, kde je monitorována reparace poškození před vstupem do následující fáze. Při aktivaci se v těchto bodech cyklus přechodně zastavuje, aby mohla být poškození reparována. Eliminace těchto kontrolních bodů (např. mutace v p53, pRb) vede k vývoji mutovaného fenotypu. V případě vzniku nereparovatelného poškození se normálně spouští apoptóza, která zabrání rozšíření mutací. Mutace, které zpožďují nebo zabraňují apoptóze tak podporují přežití geneticky nestabilních maligních buněk. Mikrosatelity Velké množství mutací (až 100 000 např. u nádoru kolonu) se nachází v tzv. mikrosatelitech - repetitivních (opakovaných) sekvencích mezi geny. Repetitivní sekvence jsou i uvnitř genů a jsou u nádorových buněk zkracovány nebo prodlužovány s vysokou frekvencí. Tak dochází patrně k inaktivaci nádorově supresorových genů během rozvoje nádorů. Na nestabilitě mikrosatelitů se ve velké míře podílejí např. ROS, takže se uvažuje o využití látek působících jako antioxidanta. Nádory vykazující nestabilitu mikrosatelitů obsahují často změny v délce repetit, sekvencí uvnitř řady genů spojených s nádory jako je APC, spec. růstové faktory-IGF, TGF-beta, metastatické geny-hMSH3,11MSH6. Téměř všechny nádory prsu a vaječníku studované s využitím srovnávací genomové hybridizace obsahují řadu změn v počtu genových kopií. Genetická nestabilita nádorových buněk se projevuje na úrovni ► nukleotidů - bodové mutace ► celých chromozómů - translokace, delece, amplifikace a aneuploidie. Nestabilita vede k mutantnímu fenotypu prostřednictvím změněné exprese proteinů, funkcí nebo efektem genové dávky. Aneuploidie - změna v počtu chromozómů - vlastnost řady nádorů. Může vzniknout fragmentací chromozómů, translokací, amplifikací nebo nondisjunkcí. Progresivní růst aneuploidie je raným počátečním dějem vedoucím ke genet. nestabilitě a je nezávislý na akumulaci jiných typů mutací. Obecně existuje pozitivní korelace mezi poetem chromozomálních změn v nádoru a maligním potenciálem tohoto nádorového onemocnění. Existují tetraploidní mezistupně po defektní mitóze nebo endoreduplikaci. Po přechodné zástavě mitózy v přítomnosti poškození vřeténka, jsou některé nádorové buňky (zejména buňky, které postrádají funkční produkty genů kontrolujících přechod Gl/S fáze jako jsou p53, pRb, p 16, p21 i buňky overexprimující myc) schopny obnovit bun. cyklus vstupem do dalšího kola syntézy DNA, což vede k endoreduplikaci. r Dva základni mechanizmy vzniku genetické nestability: ► mechanizmus zahrnující mutace v genech pro opravu nesprávných spojení DNA („mismatch repair") a manifestují se nestabilitou mikrosatelitů. Nutná mutace v obou alelách - recesivní charakter. ► mutace v genech pro segregaci chromozómů manifestující se fragmentací chromozómů nebo duplikací či delecí celých chromozómů. Stačí pouze jedna mutace, tj. fenotyp nestability chromozómů má dominantní charakter. J S růstem počtu mutací přispívá ke genetické nestabilitě jev klonální selektivity. Překážky omezující růst nádorů: ► vliv okolních tkání ► omezená výživa a přístup kyslíku ►potřeba růstových faktorů ► nedostatečné zásobování krví atd. Každá z těchto překážek může být překonána v důsledku mutací, které poskytují růstovou výhodu a ustanovují novou klonální populaci. Z každým kolem selekce dochází také ke vzniku dalších mutací. Vývoj nádoru založený na selekci mutovaného fenotypu. Jen málo mutovaných buněk překonává bariéry dalšího růstu. V každém dalším kole selekce dochází k progresivnímu obohacení o mutace v tzv. mutátorových genech nutných pro udržení genetické stability. Carcinogen Exposure Dysplasia Carcinoma íii Situ Expozice karcinogénu P^lilcratinn Omezená výživa růstové faktory rHJLriCrrn Qrowtti i Inhibice okolní matrix Inhibni^n br Invasion Ang i ggenesi * Nedostatečné zásobování Metastasis krví InjdL-qLi-iĽ Hl- A 0 Postupná maligní progrese nádoru spojená s akumulací genetických změn v buňkách o Genetická změna 0 Q + envir. faktory q O O O Genetic U O O O alteration O O O —-—*\ , O C> O O Environmental _ Q factor O ® o o o oo^oo Normal tissue Normální tkáň Genetic Genetická změna alteration oo ŕ oooou *ooono0 Pre-malignant lesion Premaligní změny o°c> o0oono o 0 o qoQo Genetic alteration s/ Primary tumor Primární nádor OooROoo Genetická změna Metastasis Metastázy I O : normal cell, Q: pre-malignant cell, ®: malignant cell without metastatic ability, #: malignant cell with metastatic ability Různé dráhy vedoucí ke vzniku mutovaného fenotypu nádorové buňky cílové mutátorové geny Target Mutator Genes efectíve is match e pa i r t í DNA Polymerase i i i i i i i i i i i i i i i T L I Double Strand Chromosomal Segregation i i Microsatellite Instability Nestabilita mikrosatelitů 1 1 1 Nucleotide 1 1 1 1 1 1 1 Metabolism Genes 1 1 1 1 1 1 1 1 1 T t T Chromosomal Losses* Alterations Ztráty a změny chromozómů Hypotéza mutovaného fenotypu předpokládá, že geny vyžadované pro udržení genetické stability jsou prvním cílem poškození DNA karcinogény. Mutace těchto genů pak vyvolávají mutace dalších genů v genomu. Sources of a Mutator Phenotype Zdroj mutátorového fenotypu EXOGENOUS ■ra>-IJ.V. ZOOGENOUS Jjcygcn teplica t ion Erf or ;hcmieal Aiteralion TARGET CÍL Mismatched Repair HNPCC Sporadic Cancers DNA Repair Genes 1 X.P.AT. I Heliesses J BIddih, Werner Syndrome Chromosome MALIGNANT PHENOTYPE MALIGNÍ FENOTYP y* Oncogenes 1 j myc. ras BUBs, MADs Cenirosome replication DMA Polymerases Nucleolkte Synthesis Cell Cycle Checkpoints Tumor Suppressors Divide frwade \ Tumor Suppressor Metastasize TÍPC- IGF TGF-3 Potenciální mitotické cíle vedoucí k aneuploidii Poruchy několika procesů zahrnující jako cíle chromozómy, mikrotubuly vřeténka a centrozómy mohou (kromě abnormální cytokineze) vést k nerovnoměrnému rozdělení chromozómů během mitózy vedoucího k aneuploidii. Karcinogeneze však znamená víc než jen mutagenezi Kromě genových a chromozomálních mutací zahrnuje i negenetické (epigenetické) změny. EPIGENETICKE DEJE způsobují změny v expresi genetické informace na transkripční, translační nebo postranslační úrovni Geny jsou zapínány a vypínány ► během vývoje ► během buněčného cyklu, když buňka proliferuje ► když buňka diferencuje ► když je diferencovaná buňka stimulována k adaptivní odpovědi Iniciovaná kmenová buňka je_omezena v dalším růstu okolními normálními buňkami. Po expozici nádorovým promotorem nebo promočními podmínkami (buněčná smrt nebo odstranění buněk) suprimující účinek okolních buněk prostřednictvím kontaktní inhibice mizí. Aberantní epigenetické a genetické děje mohou vést prostřednictvím nesprávné genové exprese k tvorbě nádorů EPIGENETIC EVENTS Aberrant methyiation and histone tail modification GENETIC EVENTS Pathway disruption p53 Inappropriate gene expression Genome instability Incomplete resetting Rb ; -(^)—-(^)— mml ■ —ig«; - Chronic DNA damage Silenced Chromatin ► Iniciovaná buňka se může dělit ale není schopna terminálni diferenciace jako normální kmenová buňka, akumulují se klony dysfunkčních buněk (papilomy, polypy, noduly, enzymově změněné fokusy). Faktory, které fungují jako nádorové promotory působí jako mitogeny a inhibitory programované buněčné smrti. Hormony, růstové faktory, cytokiny mohou fungovat jako přirozené nebo endogenní nádorové promotory. Chemikálie, mohou indukovat v buňkách různé transdukční signály, které vedou k blokáde kontaktní inhibice prostřednictvím inhibice mezibuněčné komunikace zprostředkované tzv. gap junctions. ► Totipotentní kmenová buňka je buňka, která může dát vznik všem buňkám v mnohobuněčném organismu, jako je oplodněné vajíčko nebo raná embryonální buňka. ► Brzy po embryonálním vývoji, některé buňky částečně diferencují v pluripotentní kmenové buňky. ► Z nich pak vznikají různé třídy buněk pro několik různých orgánů (např. slinivku a játra). Během dalšího vývoje jsou některé buňky omezeny tak , aby z nich vznikalo jen málo buněčných typů, stávají se z nich tzv. "komitované buňky". ► Konečným výsledkem komitovaných buněk je produkce terminálne diferencovaných buněk (spermie, vajíčka, keratinocyty, červené krvinky, neurony atd.). r V dané tkáni a orgánu i e důležitá správná regulace a rovnováha procesů PROLIFERACE DIFERENCIACE APOPTÓZA Deregulace těchto procesů vede k poruše homeostázy ve tkáni a ke vzniku nádorů SMRT TERMINÁLNI A DIFERENCIACE EXR MUTACE 2-n nebo PROGRESE MALIGNÍ ZVRAT INICIOVANÉ BUŇKY Model iniciace/promoce/progrese v karcinogenezi. (31; míra terminálni diferenciace a smrti kmenové buňky; p2, míra smrti, ale nedochází k term. diferenciaci iniciované buňky; o,,míra buněčného dělení kmenových buněk; a2, míra buněčného dělení iniciovaných buněk; jí15 míra molekulárních dějů vedoucích k iniciaci (tj., eventuálně mutaci); ju2, míra výskytu druhého zásahu v iniciované buňce. J Nádor je výsledkem mnohočetných genetických a epigenetických změn, kdy normální buňky s kontrolovaným růstem a schopností terminálne diferencovat ztrácí tyto schopnosti a zároveň získávají schopnost rozšiřovat se do jiných tkání v těle - metastázovat. Jednu z hlavních teorií karcinogeneze představuje tzv. teorie kmenových buněk. Pozorování, že každý nádor se jeví jako monoklonální ve svém původu, tj. přes všechny genotypové a fenotypové rozdíly se všechny buňky nádoru vytvořily z jedné původní kmenové. Základní předpoklad zmíněné teorie karcinogeneze je, že normální kmenová buňka je nesmrtelná. Smrtelnou se stává při indukci terminálni diferenciace. Kmenové buňky se dělí "asymetricky", tj. jedna dceřinná buňka zůstává jako kmenová a druhá získává schopnost terminálne diferencovat. S tím souvisí domněnka, že prvním krokem v karcinogenezi je imortalizace buňky. Každý nádor obsahuje malou část buněk schopných sebeobnovy : Nádorové kmenové buňky - zodpovědné za neomezený růst, minimální reziduálni chorobu, následné obnovení nemoci a metastázování. Schopnost repopulace hostitele (pacienta) danou neoplasií (včetně všech elementů, linií a subklonů primárního nádoru) po neomezenou dobu. Důležitý cíl terapie Neoplastické kmenové buňky identifikovány u myeloidních leukémií, nádorů prsu, prostaty, mozku a vaječníku. 3 základní kritéria kmenových buněk: 1) Schopnost sebeobnovy, tj. proliferace bez diferenciace a bez ztráty proliferační kapacity, což umožňuje udržení zásoby nediferencovaných kmenových buněk během života 2) Seberegulace počtu kmenových buněk rovnováhou mezi sebeobnovou a diferenciací dělících se dceřinných buněk 3) Schopnost diferenciace a maturace dostačující pro rekonstituci a dlouhodobé přežití všech funkčních elementů dané buněčné populace (buněčná linie, tkáň, orgán, neoplastický klon) Při vzniku nádorů působí dva typy mechanizmů: environmentálni faktory a genetické vybavení jedince V některých případech je primární en vir. faktor, který způsobí vznik nádoru u "normálního" jedince. Avšak i v tomto případě jsou zasaženy geny, protoonkogeny a nádorově supresorové geny. Kromě toho existují další geny, které mohou způsobit větší či menší citlivost (susceptibility) jedince k envir. faktorům. Předpokládáme-li, že všechny nádory jsou výsledkem iniciační, promoční a progresivní fáze karcinogeneze, měly by existovat geny, které a) buď chrání nebo predisponují protoonkogeny nebo nádorově supr. geny k aktivaci nebo inaktivaci, b) selektivně podporují nebo suprimují růst a expanzi iniciované buňky, c) zabraňují nebo zvyšují možnosti získání genetické/epigenetické nestability iniciované buňky, které zapříčiňují její malignitu. Lidské genetické syndromy: Albinismus - jedinci nemají melaninovou pigmentaci, která chrání kůži nebo oči před škodlivými účinky UV záření. Normální DNAreparační mechanismy, ale množství poškození je větší než je tento systém schopen zvládnout. Nereparovaná poškození DNA fungují jako substrát pro vznik mutací v protoonkogenech nebo nádorově supr. genech. Syndrom je klasifikován jako jako typ náchylný ke vzniku nádorového onemocnění. Protože poškození DNA je velké, mnoho buněk umírá a smrt kožních buněk stimuluje kompenzační - regenerační růst buněk přežívajících - možnost promoce iniciovaných buněk. Klony iniciovaných buněk dále exponované UV - zvýšena pravděpodobnost dalších mutačních (genetických)změn - postup populace buněk do progresívního stadia. Xeroderma pigmentosum - genetický syndrom, který také předurčuje jedince k rakovině kůže, avšak na jiném principu. Jedinci jsou nositeli genu, který neumožňuje reparovat poškození DNA indukované UV. Výsledkem jsou nereparovaná poškození DNA, která vedou ke smrti buněk nebo k mutacím. Podobně jako u albínů dochází ke kompenzační hyperplazii při náhradě odumřelé tkáně. Iniciovaná buňka kůže proliferuje, ale nediferencuje. Vytváří klon iniciovaných buněk (papilom) citlivý k indukci dalších genet/epigenet. změn a k progresivnímu rozvoji. Jedinci s albinismem nebo XP však nejsou odsouzeni k nádorovému onemocnění. Jestliže je pokožka chráněna před UV, nemusí být vyvoláno. Při nadměrném působení UV mohou být postiženi i "normální" jedinci. Reparační systém přetížen a vzniká poškození DNA vedoucí opět k mutacím a ke smrti buněk podobně jako v předchozích případech. Jedinci s větší pigmentací jsou lépe chráněni před škodlivými účinky UV. Existuje řada en vir. faktorů a genů, které předurčují nebo chrání jedince před vznikem nádorů. Existuje řada chemikálií buď exogenních (dieta, životní styl, léčiva, polutanty) nebo endogenních (hormony, růstové faktory), které nepoškozují DNA a nejsou mutagenní. Jsou to negenotoxicky působící látky, které mohou působit jak promoční stimulací proliferace iniciované buňky tak supresí apoptózy. Jedinci, kteří jsou normálně exponováni a akumulují iniciované buňky (což se normálně děje s přibývajícím věkem), ale kteří jsou exponováni abnormálnímu množství promočních látek v těle v důsledku genetického defektu jsou označování jako "promotion-prone". Vyloučení působení nádorových promotorů může u normálních jedinců snížit vznik nádorů přesto, že dojde k iniciaci. Naopak pravidelná a chronická expozice dostatečnému množství nádorového promotoru zvyšuje riziko vzniku nádoru. Podobně jako existují antiiniciátorové geny a látky, tak existují i geny a látky působící antipromočně. NÁDOROVÁ GENETIKA Zárodečná b. (Z) and somatická b. (S) 1 S Blooms. RB1 BLt(8;14) Fanconis. TP53 ALLt(11; ) AT WT1 CML t(9; 22) XP NF1 ESt(11;22) ARMS t(2; 13) Geny predisponující jedince k nádorům mohou být mutovaný v zárodečné linii a produkovat recesivně děděné onemocnění jako je Bloomův a Fanconiho syndrom, AT a xeroderma pigmentosum. Ostatní, jako RB1, TP53, NF1 a Wilmsův tumor 1 (WT1), mohou být mutovaný v zárodečné linii, čímž vzniká náchylnost u heterozygotů nebo somaticky v případě nedědičných případů nádorů. Mnoho somatických translokací je spojeno se specifickými chorobami, jako je Burkittův lymphom (BL), akutní lymfocytární leukémie (ALL), chronická myeloidní leukémie (CML), Ewingův sarkom (ES) a alveolárni rhabdomyosarkom (ARMS). t(11; ) translokace může zahrnovat kterýkoli z velkého počtu chromozómů partnerských k chromozómu 11. 7 W jednotlivé buňce mutace jostupně a společně podporují odchylku od regulovaného růstu a nastavují nebo revertují specializaci buňky. / Změny buněčné topografie I nchvcení mění vlastnosti Wchu"buňky a umožňují ejí odpoutání od sousedníc bnněk. Fo^něněné nebo nefunkční receptory pak ovlivňují transport přes membránu. Uvnitř buňky se mění metabolismus, iádro mění tvar, dochází ke shlukování ohromatinu, zlomům v | chromosomech a poruchám buněčného dělení. >od vrstvou epitelu jiné )uňky produkují kolagenázu a jiné proteázy, které narušují extracelulární natrix a usnědňuií tak další fázi - invazi. bilrte With clu'"••(.!'r>|;f B'-TI-'Jlf Él Setting the Stage for Cancer _ í H j irpkinWriU jdW STROMAi FIBROBLASTS CoHagenase and otfier protease* řemgiel ECM 1& fccilitflte invasion i ■ i..':■■.-!-s ttqutfitiallyundcollectively promoiedeviationfromnormal ulriL, wIiHl halting úf reVerimg Lpeojalizatrurt. Alterations, ttt iHttdľs nd attachments make its lurfice úfier, cau-Lmg il to pull áifjy fr^-rtn its . irnpdned oť mj&Smfl TeCephirS Compromise Lamport irJOíí the rtlertl-n the cell, ťrrtubafisrti revs a.s the nucleus appear to urtdulate, ihromatin thttmaiDrneS treik, fthilc it the idrtle tlrtle dlVIirjn prepJrdtlonL erlSue. ťpltheliál lining lh« iríiňl Celí releases ColliflendLi and other protease5-■ľaL jwiy jt !L!í -Ktracellul&r matrix, ľa-lilitďljn^; Ifie nPXt äíaflc. Invasion ■ Proteases ■Cŕúvťťh factors • tyloklrtes • ArtJjogtneSIS průrrtoteťi ■íelluJji adhesion molecuJŕS O- J hr KíH'nNil M'F'ďrnFi-r 2£. ZltfU \\ý Vn-iHnC |ľ?